李寶國(guó)　杜　雪　張孝衛(wèi)

[摘要] 目的:研究水牛角酶解的最佳提取工藝。方法:以蛋白質(zhì)含量為指標(biāo),通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選水牛角的最佳酶解提取條件。結(jié)果:水牛角最佳酶解工藝為:胃蛋白酶,pH=2,加酶量700 U/g,溫度39℃,時(shí)間4 h。結(jié)論:正交實(shí)驗(yàn)確定的條件可較好地應(yīng)用于水牛角的酶解提取。

[關(guān)鍵詞] 正交實(shí)驗(yàn);水牛角;酶解;提取工藝

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-4721(2009)07(b)-024-02

水牛角始載于《名醫(yī)別錄》,為?？苿?dòng)物水牛BubalusbubalisLinnaeus的角,為臨床常用中藥,性寒,味苦,具有清熱解毒、涼血、定驚的功效,用于溫病高熱、神昏譫語(yǔ)、發(fā)斑發(fā)疹、吐血衄血、驚風(fēng)、癲狂等癥[1]。文獻(xiàn)資料表明對(duì)水牛角的活性物質(zhì)及藥理活性研究較少,原藥材直接口服,生物利用度低,我們模擬人體胃腸道環(huán)境,采用生物酶仿生提取技術(shù),以正交實(shí)驗(yàn)篩選水牛角粉的提取工藝,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備

電子天平;恒溫水浴鍋;H198107筆式酸度計(jì);UV-120-02分光光度計(jì);NO1506-017紫外分光光度掃描儀。

1.2 試劑與材料

水牛角粉(成都千方中藥飲片有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z51022471);胃蛋白酶(活性1∶4600,濟(jì)南亞康力諾生物工程有限公司,批號(hào)070323);牛血清白蛋白(Roche公司);考馬斯亮藍(lán)G250(上海化學(xué)試劑站分裝廠,批號(hào)061005)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1檢測(cè)方法的建立

2.1.1 考馬斯亮藍(lán)試劑的配制

精密稱取考馬斯亮藍(lán)G 250 10 mg于100 ml容量瓶中,加5.00 ml乙醇使溶解,再加85%磷酸溶液10 ml,蒸餾水定容至刻度[2]。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的制備

精密稱取25 mg牛血清白蛋白置于25 ml的容量瓶中,定容至刻度,配成1 000 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2.1.3 樣品液的制備

稱取水牛角粉1.00 g,加入胃蛋白酶0.55 g,9.00 ml蒸餾水中,濃鹽酸調(diào)pH=(2.00±0.01),在(37.0±0.1)℃水浴中提取4 h。提取液放入85℃的水浴中滅活15 min后用濾紙過(guò)濾,得濾液,稀釋10倍,以12 000 r/min離心10 min,取上清液作為樣品液[3]。

2.1.4陰性樣品液的制備

按照2.1.3項(xiàng)下,無(wú)水牛角粉,同法制備陰性樣品液。

2.1.5 測(cè)量波長(zhǎng)的確定

分別精密取蒸餾水、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、樣品液、陰性樣品液各1.00 ml,依次加入5.00 ml考馬斯亮藍(lán)試劑,在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明,牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、樣品液在波長(zhǎng)為595 nm都有最大吸收,陰性樣品液干擾較小,選擇595 nm為測(cè)量波長(zhǎng)。

2.1.6 線性關(guān)系的考察

分別制備不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,加入考馬斯亮藍(lán)試劑,在595 nm測(cè)吸光度,以A 595 nm為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=0.010 97X-0.070 89,r=0.999 8,線性范圍為20～100 μg/ml。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1正交試驗(yàn)因素水平

參考文獻(xiàn)[4-5],根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇胃蛋白酶、9倍水,確定正交實(shí)驗(yàn)因素水平,以L9(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.2.2 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果

方法:取水牛角粉1.00 g,加入胃蛋白酶,蒸餾水9.00 ml,鹽酸調(diào)pH值,水浴提取。提取液85℃滅活15 min,濾過(guò),稀釋濾液,12 000 r/min離心,上清液作為樣品液。取樣品液,加入考馬斯亮藍(lán)試劑,595 nm測(cè)吸光度,經(jīng)分析,酶解最佳條件為A2B2C2D2,即:加酶量700 U/g、溫度39℃、pH=2、時(shí)間4 h。。

2.3工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用A2B2C2D2條件進(jìn)行3次工藝驗(yàn)證,RSD=1.61%,結(jié)果表明酶解提取工藝良好。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,水牛角最佳酶解提取工藝為:胃蛋白酶、9倍水、700 U/g、39℃、pH=2、時(shí)間4 h。酶的特點(diǎn)是催化效率高,專一性強(qiáng),作用條件溫和。蛋白酶能使蛋白質(zhì)水解成肽和氨基酸,提高和改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性、黏度等。生物酶仿生提取能避免酸法水解和堿法水解對(duì)蛋白類物質(zhì)的破壞和變旋作用,有利于防止活性成分失活損失,確保臨床療效。中藥材直接口服,一般生物利用度低,浪費(fèi)原料。本研究模擬人體胃腸道環(huán)境,采用生物酶仿生提取水牛角活性物質(zhì),利于防止活性成分失活損失,建立了一種用于水牛角酶解物的檢測(cè)方法,為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為動(dòng)物類藥材活性物質(zhì)的提取分離提供了一種新的思路和方法學(xué)借鑒。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:56-57.

[2]路蘋(píng),于同泉,王淑英,等.蛋白質(zhì)測(cè)定方法評(píng)價(jià)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(2):65-69.

[3]劉芳,王遂.酶法提取變性脫脂豆粕中蛋白質(zhì)的研究[J].食品科學(xué),2004,25(3):89-92.

[4]林超,王玉蓉,吳清,等.全蝎的酶解工藝研究[J].中藥制劑,2005,28(6):66-69.

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(收稿日期:2009-04-13)