張善玉 葛 娜

近年來,隨著基因工程學、分子生物學和現代分離技術的快速發(fā)展,蛋白質也成了一項質量和資源評價的指標,故探索測定蛋白質含量的方法有著重要的意義[1]。目前測定蛋白質含量的常用方法有凱氏定氮法、考馬斯亮藍法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Folin酚試劑法和雙辛可寧酸法[2]等。這些方法也分別應用于測定不同中藥材中蛋白質含量。

1 考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍法是 Bradford于1975年建立的一種色素結合法。其主要原理是考馬斯亮藍G250在酸性溶液中與蛋白質通過范德瓦爾引力結合形成最大吸收峰為595 nm的復合物,其吸光度與蛋白質含量在200～1400 μg/ml之間呈線性關系,故可用于蛋白質含量的測定[3]。趙英永[1]等探討了考馬斯亮藍G250染色法測定草烏藥材中可溶性蛋白質含量的方法,并建立了快速、靈敏的測定蛋白質的方法。

由于植物粗提液中含有許多其他物質,如酚類物質、核酸等,而且蛋白質的含量比較低,因而諸如Folin酚法,雙縮脲法,紫外吸收法等的應用受到了一定的限制,而考馬斯亮藍法靈敏度高,操作簡便,特異性強,快速,且不受酚類物質的影響,因而常常在植物組織粗提液中可溶性蛋白質含量的測定中被采用[4]。但是,目前還不清楚是否所有的植物蛋白質都可以用這種方法測定[5]。

2 凱氏定氮法

凱氏定氮法 [6]為經典的測定蛋白質的方法。是目前分析有機化合物含氮量常用的方法,是測定試樣中總有機氮最準確的方法之一,被國際國內較多作為法定的標準檢驗方法[7]。周燕等[8]進行了八味沉香膠囊中總蛋白質的含量測定,結果可靠,精密度高,重現性好,可作為該品的質量控制方法。韓定獻[9]等也采用此法進行了天力保膠囊中蛋白質和氨基酸的含量測定,測得蛋白質含量為23.00%。利用凱氏定氮法對金銀花枝葉中蛋白質含量進行了測定,結果顯示,金銀花葉中的蛋白質含量與花中含量極為相近[10]。

雖然,凱氏定氮法為測定含氮量抽象算蛋白質的方法,測定結果的重復性和重現性都很好。但此法操作繁瑣,試劑消耗量大,消化時排放的SO2對人體健康造成直接危害,而且費時、費電、費水。

3 雙縮脲法

雙縮脲法測定蛋白質含量的原理是,在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,這種紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定各種蛋白質含量[11]。汪良駒等[5]探討了用此法測定銀杏葉片可溶性蛋白質含量,結果表明雙脲試劑與銀杏葉片可溶性蛋白質反應迅速、穩(wěn)定,適合于這種果樹葉片可溶性蛋白質測定。應用雙縮脲法測定決明子中蛋白質含量結果表明,決明子中蛋白質含量較高 [12]。

4 Folin酚試劑法

Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高(比雙縮脲法靈敏得多),缺點是費時間較長[13],要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多?？禆|周[14]等認為用 Lowry 法測定蛋白質含量時,酚類、單糖類等干擾測定,因此需先經過蛋白沉淀的處理過程,排除干擾物質的影響。吳瑾瑾 [15]等采用Folin酚試劑法測定了康克膠囊中可溶性蛋白質的含量,結果蛋白質在25～300 μg/ml范圍內呈良好的線性關系,r≥0.9990,方法靈敏、準確、重復性好。利用此法測定靈芝產品中多糖肽的含量,結論是本法穩(wěn)定可靠、簡便快速,可作為靈芝及其產品質量控制指標[16]。

5 紫外分光光度法

蛋白質分子中,一些氨基酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質在280 nm處有吸收,其光密度值與蛋白質含量成正比,可用于蛋白質含量的測定[11]。本方法定量過程中無試劑加入,蛋白可回收,且方法簡便[17]。曹艷等[18]用紫外吸收法測定了半夏總蛋白含量,結論是由于不同樣品中干擾成分差異較大,致使280 nm紫外吸收法的準確性稍差。故本實驗只適用于總蛋白的含量測定。因此,就含有大量復雜成分的中藥材中蛋白質含量測定而言,最好是先進行蛋白純化后在用紫外分光光度法測定。

6 其他方法

隨著蛋白質組學研究技術的深入發(fā)展,蛋白質組學在基礎研究、農業(yè)、醫(yī)藥學研究中得到廣泛的利用,近年來也應用于中藥材鑒別和蛋白質的半定量。如在二維電泳基礎上的染色方法進行蛋白質的定量是應用較多的方法之一。唐任能[19]等采用SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳和BCA蛋白含量測定法比較了鹿茸、鹿托盤、鹿骨水溶性總蛋白差異。結論是SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳法及BCA蛋白含量測定法是鑒別鹿茸、鹿托盤及鹿骨有效方法。另外,利用凱氏定氮法對板藍根、南板藍根和大青葉的生藥和相應的新鮮植物組織中的總蛋白含量進行測定,提取液中的蛋白質組分應用SDS2PAGE電泳進行分析,證實了三種藥材的蛋白質種類和含量有一定差別,且同種藥材的新鮮植物組織和生藥蛋白質組分在含量和種類上有明顯差別[20]。

7 結束語

總之,雖然蛋白質含量的測定方法很多,但是,還沒有一個完美的測定中藥材中蛋白質含量的方法。在選擇方法時應考慮實驗對測定所要求的靈敏度和精確度;中藥材中蛋白質的性質;中藥材中存在的干擾物質;測定所要花費的時間等各種因素。在選擇測定方法時,可根據實驗要求和實驗室條件決定,從而選出適合且誤差較小較準確的方法。

參考文獻

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