MHCⅡ類(lèi)轉(zhuǎn)激活因子基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建

張敏敏 楊驊 金晶 吳紅玉 李兆申

·論著·

MHCⅡ類(lèi)轉(zhuǎn)激活因子基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建

張敏敏 楊驊 金晶 吳紅玉 李兆申

目的構(gòu)建含有主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ類(lèi)分子激活物(CⅡTA)基因的重組腺病毒載體。方法回收CⅡTA的PCR產(chǎn)物插入pUC57中，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，U-Gene凝膠回收純化3300bp目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pShuttle-GFP-CMV，用T4DNA連接酶將上述目的基因片段與pShuttle-GFP-CMV片段連接，得到穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA，并經(jīng)KpnⅠ單酶切及測(cè)序鑒定。Ⅰ-CeuⅠ/Ⅰ-SceⅠ雙酶切處理，回收目的片段，將pAdxsi載體片段和插入片段進(jìn)行酶連接，得到腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-CⅡTA，經(jīng)Xho I酶切鑒定后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并培養(yǎng)出毒。擴(kuò)增、純化重組腺病毒AdCⅡTA，并測(cè)定病毒滴度。結(jié)果重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA經(jīng)Kpn I單酶切及測(cè)序分析，證實(shí)與GeneBank中公布的小鼠CⅡTA(NM_007575)序列完全相符。重組腺病毒pAdxsi-GFP-CⅡTA構(gòu)建成功后在HEK293細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒AdCⅡTA對(duì)HEK293細(xì)胞有致病作用。經(jīng)多次重復(fù)感染并純化后，病毒滴度達(dá)2.0×1011PFU/ml。結(jié)論含小鼠CⅡTA基因的重組腺病毒已成功構(gòu)建。

胰腺腫瘤; 基因，MHCⅡ類(lèi); 基因療法

表達(dá)明顯減少或缺失，致使T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原不能識(shí)別，腫瘤細(xì)胞得以逃避宿主的免疫攻擊[1-2]。MHCⅡ類(lèi)轉(zhuǎn)激活子(MHC class Ⅱ transactivator, CⅡTA)是MHCⅡ類(lèi)基因表達(dá)的“分子開(kāi)關(guān)”，對(duì)MHCⅡ類(lèi)基因的組成和誘導(dǎo)表達(dá)起關(guān)鍵作用。高度轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)下降，其與CⅡTA的表達(dá)降低密切相關(guān)[3-4]。外源性的CⅡTA能夠促進(jìn)MHCⅡ基因轉(zhuǎn)錄的激活[5]，改變MHC分子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤抗原的提呈，從而達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的目的[3]。為此，我們構(gòu)建了CⅡTA基因重組腺病毒的表達(dá)載體，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA的構(gòu)建及鑒定

參照文獻(xiàn)[6]的方法。先設(shè)計(jì)擴(kuò)增CⅡTA全基因引物。上游引物5′-AATAGAGAGCCACCA-GGGGT-3′，下游引物5′-GTGCTTCTGAGTGCTGCCT-3′，產(chǎn)物片段3300 bp。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 4 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物電泳后，用U-Gene凝膠回收試劑盒回收、純化。應(yīng)用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，將PCR產(chǎn)物插入pUC57質(zhì)粒，制備目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pShuttle-GFP-CMV，用T4DNA連接酶將上述目的基因片段與pShuttle-GFP-CMV片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a。挑取平板中單個(gè)菌落，接種含100 μg/ml Amp的5 ml LB培養(yǎng)液內(nèi)，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。酶切法鑒定陽(yáng)性菌液。并送上海Sangon公司測(cè)序鑒定。

二、pAdxsi-GFP-CⅡTA的構(gòu)建與鑒定

用Ⅰ-CeuⅠ/Ⅰ-SceⅠ雙酶切腺病毒載體pAdxsi，同時(shí)雙酶切穿梭質(zhì)粒載體pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA，回收目的片段，連接病毒載體片段和目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布到氨芐抗性固體培養(yǎng)基平皿，挑取若干單克隆菌落，接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液加入LB培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜，大量提取重組腺病毒，行XhoⅠ酶切鑒定。

三、腺病毒的重組及鑒定

將HEK293細(xì)胞(購(gòu)自加拿大Microbix Biosystems lnc．)接種于6孔板中，每孔5×105細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。換新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的80%～90%時(shí)，取重組腺病毒pAdxsi-GFP-CⅡTA，采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體(GIBCO BRL產(chǎn)品)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第2天，將長(zhǎng)滿的細(xì)胞傳代于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)再轉(zhuǎn)入75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細(xì)胞出毒跡象。出毒現(xiàn)象為細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開(kāi)始出現(xiàn)明顯噬斑。第8天出現(xiàn)細(xì)胞出毒現(xiàn)象；第11天大部分細(xì)胞病變并從底部脫落，將培養(yǎng)瓶置-70℃冰箱和37℃水浴鍋中反復(fù)凍融3次，3000 r/min離心5 min，收集含重組腺病毒(AdCⅡTA)的上清液，為第一代毒種(P1)。

取第一代毒種50 ml接種于25 cm2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，按前述方法培養(yǎng)、凍融、離心收集病毒上清液，此為第二代毒種(P2)。取200 μl P2上清液，加入20 μl蛋白酶K、200 μl Buffer AL，置56℃水浴10 min，加入200 μl無(wú)水乙醇，震蕩混勻。將混合物放入2 ml收集柱內(nèi)，8000 r/min離心1 min，棄柱下收集管，換新管。向柱內(nèi)加入500 μl Buffer AW1，8000 r/min離心1 min，換柱下收集管。再向柱內(nèi)加入500 μl Buffer AW2，13 000 r/min離心3 min，柱下?lián)Q新EP管。向柱內(nèi)加入100 μl Buffer AE，室溫放置1 min，8000 r/min離心1 min，重復(fù)1次。收集2次流出液，取5 μl作為模板，進(jìn)行PCR鑒定。CⅡTA上游引物5′-CTATGTCCCCTG-TCATTGCTT-3′，下游引物5′-GTCTTGGTTCCC-CGCTGT-3′，產(chǎn)物430 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行凝膠電泳分離，觀察。

四、AdCⅡTA的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定

在5個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶中分別接種4×106個(gè)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，加入2 ml P2液，待細(xì)胞完全病變后，凍融3次，離心取病毒上清。然后在4個(gè)轉(zhuǎn)瓶同法染毒70 h后收獲病變細(xì)胞混懸液。3000 r/min離心10 min， Tris緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，反復(fù)凍融3次，6000 r/min離心取上清，用DNase消化、0.45 μm濾膜過(guò)濾、SOURSE 15Q和分子篩純化。純化后的病毒保存于腺病毒保存液中，經(jīng)除鹽處理后用0.22 μm一次性濾器除菌，分裝保存于-80℃冰箱。用10×的病毒裂解液裂解純化病毒樣品,測(cè)定A260和A280。每ml制品中的病毒顆粒數(shù)(VP/ml)=A260×1.1×1012。

結(jié) 果

一、重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA鑒定

pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA經(jīng)Kpn I單酶切后得到2300 bp及6100 bp兩個(gè)片段(圖1)，符合目的片段長(zhǎng)度。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析，與GeneBank公布的小鼠CⅡTA(NM_007575)序列完全相符。

二、重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-CⅡTA鑒定

pAdxsi-GFP-CⅡTA經(jīng)Xho I酶切后得到7個(gè)片段(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致。

三、重組腺病毒AdCⅡTA的鑒定及滴度

pAdxsi-GFP-CⅡTA在HEK293細(xì)胞中包裝產(chǎn)生重組腺病毒AdCⅡ TA。對(duì)HEK293細(xì)胞有致病作用。轉(zhuǎn)染后第2天開(kāi)始出現(xiàn)明顯噬斑，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖3)。

分離收集的病毒，經(jīng)PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出430 bp的特異性片段(圖4)。

用收集的病毒感染HEK293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒，44 h后完全出毒。多次重復(fù)感染并純化后，病毒滴度達(dá)2.0×1011PFU/ml。

圖1 經(jīng)Kpn I酶切的pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA產(chǎn)物電泳圖

圖2 Xho I酶切的pAdxsi-GFP-CⅡTA的產(chǎn)物電泳圖

圖3 AdCⅡTA感染的HEK293細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光

M: marker；1:陽(yáng)性對(duì)照；2:AdCⅡTA病毒；3:陰性對(duì)照

討 論

促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的提呈，制備安全、高效的腫瘤疫苗以提高腫瘤免疫原性，已成為目前腫瘤免疫治療中最受青睞的研究熱點(diǎn)之一。MHCⅡ類(lèi)分子主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及APC表面，是T、B細(xì)胞活化的必要信號(hào)。1993年,瑞士科學(xué)家Mach發(fā)現(xiàn)了一種能使裸淋巴細(xì)胞綜合征患者重新表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的新基因CⅡTA[6]。CⅡTA可以定量控制MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)，與MHCⅠ類(lèi)分子及各種抗原遞呈相關(guān)基因如Ii、DM等的表達(dá)也有關(guān)[7-8]。

腺病毒是基因疫苗、基因治療、組織工程等研究中應(yīng)用最廣泛的載體之一[9]。本研究選用的Adxsi腺病毒，缺失E1/E3，可允許攝入大的片段，并具有I-Ceu I和I-Sce I酶切位點(diǎn)，能識(shí)別較長(zhǎng)的非回文序列，2種酶一起使用還可提高連接效率。此外，我們選用的pShuttle-GFP-CMV質(zhì)粒攜帶綠色熒光蛋白基因(GFP)，能直接在熒光倒置顯微鏡下觀察目的基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們成功構(gòu)建了含小鼠CⅡTA基因的重組腺病毒，病毒滴度達(dá)2.0×1011PFU/ml，為下一步進(jìn)行CⅡTA基因?qū)δ[瘤，特別是胰腺癌的治療等研究奠定基礎(chǔ)。

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2009-10-10)

(本文編輯：屠振興)

ConstructionofMHCclassⅡtransactivatorrecombinantadenovirusvector

ZHANGMin-min,YANGHua,JINJing,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZHANGMin-min,Email:minminzhang2002@126.com

ObjectiveTo construct a recombinant adenovirus vector containing the gene of major histocompatibility complex (MHC) class Ⅱ transactivator (CⅡTA).MethodsThe restriction fragment of CIITA was inserted into pUC57 vector with EcoRⅠ and XhoⅠ. Then, recombinant plasmid pShuttle-GFP-CMV CⅡTA was constructed with EcoRⅠ and SalⅠ, and was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. After the treatment with Ⅰ-Ceu Ⅰ and Ⅰ-Sce Ⅰ, the fragment CⅡTA from recombinant plasmid pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA was inserted into vector pAdxsi. And the pAdxsi-GFP-CⅡTA was packed into liposome, and was transfected to 293 cells.ResultsRecombinant plasmid pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA was constructed successfully. After packed into vector pAdxsi, and transfected to 293 cells, significant virus plaques were observed, which showed the successful homologous recombination. The titer of the purified AdCⅡTA was 2.0×1011PFU/ml.ConclusionsRecombinant adenovirus AdCⅡTA containing gene of MHC class Ⅱ transactivator was established successfully.

Pancreatic neoplasms; Genes, MHC classⅡ; Gene therapy

在多數(shù)腫瘤，包括胰腺癌，主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ類(lèi)分子

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.012

國(guó)家自然科學(xué)基金(30600752)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

張敏敏，Email: minminzhang2002@126.com