應(yīng)用DGGE技術(shù)分析扇貝養(yǎng)殖海區(qū)真核浮游生物種群多樣性*

王 娜,蔡玉勇,,李 赟**,王崇明,崔 紅

(1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071;3.山東省濰坊市畜牧檢測中心,山東濰坊261061)

應(yīng)用DGGE技術(shù)分析扇貝養(yǎng)殖海區(qū)真核浮游生物種群多樣性*

王 娜1,蔡玉勇1,2,李 赟1**,王崇明2,崔 紅3

(1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071;3.山東省濰坊市畜牧檢測中心,山東濰坊261061)

為分析扇貝養(yǎng)殖海區(qū)真核浮游生物種類和豐度,本研究首先以實驗室培養(yǎng)的9種餌料微藻總DNA為模板PCR擴增18S rDNA V 1～V 3區(qū)的高變區(qū)序列,篩選用于DGGE分析該擴增序列的變性劑濃度,結(jié)果表明,擴增序列長560 bp,DGGE分析可將不同藻種分離開。隨后對青島沙子口扇貝養(yǎng)殖海區(qū)9個月份真核浮游生物多樣性進行了DGGE分析,結(jié)果從9個月份2 m深的海水中總共擴增出38條譜帶,其中共有譜帶3條,占總數(shù)的7.69%,不同月份的特征性譜帶11個,占總譜帶數(shù)的28.2%。不同月份水樣中的譜帶數(shù)顯著不同,香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.4632。相似性分析表明,2009年3和4月養(yǎng)殖海區(qū)真核微生物種類相似性最高,為89.7%?；诓煌路菟畼游⑸锓N類多樣性進行UPGMA聚類分析,結(jié)果表明,2008年5,6,8月和2009年1,2,3,4月分別聚為一支,顯示取樣時間相近的月份微生物種類相似度最高。

PCR-DGGE;18S rDNA序列;真核浮游生物多樣性

海洋中的浮游生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,是水系統(tǒng)中占優(yōu)勢的初級生產(chǎn)者,浮游微藻通過光合作用將無機物(如硝酸鹽,磷酸鹽)轉(zhuǎn)化成新的有機物(脂肪,蛋白質(zhì)等),為多種海洋動物幼體或成體提供豐富多樣的餌料,是海洋生態(tài)食物鏈的重要組成部分。扇貝是濾食性貝類,通過濾食海水中大小合適的浮游生物,養(yǎng)殖海區(qū)浮游生物的種類及豐度直接影響到扇貝攝取食物的質(zhì)量和數(shù)量,從而影響到養(yǎng)殖扇貝的生長,因此,分析養(yǎng)殖海區(qū)浮游生物的群落結(jié)構(gòu)及季節(jié)性變化對于扇貝養(yǎng)殖具有重要意義。

自1979年Fischer和Lerman提出了DGGE(變性梯度凝膠電泳)技術(shù)以來,基于16S rDNA多變區(qū)序列,已有研究對土壤[1-2]、湖泊[3-4]、動物腸道[5]及藍藻的群落變化[6]進行了分析,結(jié)果證明該技術(shù)可以對擴增片段堿基的微小差異進行準確的分離,對微生物的種類和豐度進行定性和定量的研究。在真核浮游生物的研究方面,Beatriz Díez等對真核浮游生物[7]、鮑磊等對廈門西海域的超微型浮游植物[8]、Yan Qingyun等對三峽庫區(qū)的原核和真核浮游生物[9]、Rebecca J.Gast等對原生動物[10]、馬曉軍等對冰川的真核微生物的群落結(jié)構(gòu)[11]分別進行了分析,探討了不同生態(tài)環(huán)境真核微生物的遺傳多樣性。與傳統(tǒng)的鏡鑒技術(shù)相比,該技術(shù)對采集樣品中的高豐度和低豐度生物、微型和超微型生物均可以進行分析,相對傳統(tǒng)方法分析更為全面,而且分析效率也大大提高,顯示該技術(shù)在研究真核浮游生物方面的潛在優(yōu)勢。有關(guān)扇貝攝食餌料的研究,僅有王如才等[12]利用鏡鑒統(tǒng)計方法進行的研究,本研究首先通過9種培養(yǎng)微藻的分析篩選了PCR-DGGE分析的合適凝膠濃度和變性劑梯度,隨后對青島沙子口扇貝養(yǎng)殖海區(qū)9個月份的真核浮游生物種類多樣性進行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

用于本研究DGGE分析的樣品包括實驗室培養(yǎng)微藻和養(yǎng)殖海區(qū)采集的海水樣品。

實驗室培養(yǎng)微藻有9種,分別為1:綠色巴夫藻Pav lova viridis;2:小新月菱形藻N itzschia closterium m inutissim a;3:綠色杜氏藻D unaliella viridis;4:中肋骨條藻Skeletonem a costatum;5:湛江叉邊金藻D icrateria inornata;6:小亞德里亞共生藻Gym nodinium m icroadriaticum;7:新月菱形藻N itzschia closterium;8:扁藻Platymonas subcordiform is;9:三角褐指藻Phaeodacty lum tricornutum。所有微藻分別培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)基中,光周期為12 h∶12 h。培養(yǎng)至指數(shù)生長期離心收集。

海水樣品為2009年1月6日、2009年2月23日、2009年3月17日、2009年4月10日、2008年5月11日、2008年6月24日、2008年8月19日、2008年10月10日、2008年12月15日分別采自青島沙子口扇貝養(yǎng)殖海區(qū)2 m深的海水。采集的5 L水樣立即在實驗室以6 000 r/min離心45min收集,沉淀物分裝5個2 m L小離心管再經(jīng)10 000 r/min離心30 min,棄上清后-80℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組總DNA提取 取1 L海水樣收集的浮游生物沉淀,加入65℃預(yù)熱的提取緩沖液[13](3%CTAB,1%PVP,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl(p H=8.0),0.1 mol/L EDTA,0.2%β-巰基乙醇)500μL,65℃水浴1 h后加入蛋白酶K(終濃度為0.2 mg/mL),55℃溫浴30 min。隨后加入1/3體積的5 mol/L KAc(p H=8.0)[13]混勻,放置20 min,加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),輕緩搖勻10 min,10 000 r/min離心10 min。上清液移至新管,并加入2/3體積異丙醇,于4℃冰箱中過夜,經(jīng)12 000 r/min離心15 min沉淀DNA,棄上清。70%的乙醇洗滌2～3次,無菌風下吹干后溶于50μL TE緩沖液(10 mmolTris-HCl,1 mmol EDTA),-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的PCR擴增 以提取的基因組DNA作為反應(yīng)模板,基于Beatriz Díez等[14]報道,擴增18S rDNA基因V 1～V 3可變區(qū)的引物為Euk1A和Euk516r,序列分別是,Euk1A(5′-CTGGTTGA TCCTGCCA G-3′),Euk516r(5′-ACCA GACTTGCCCTCC-3′)。為DGGE分析,在引物Euk516r的5′附加40 bp的GC發(fā)卡結(jié)構(gòu),序列為5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′。預(yù)期擴增片段長度為560 bp。

50μL的PCR反應(yīng)體系包括:5μL 10×buffer(含M g2+),4μL 2.5 mmol/L的dN TP混合物以及1.5μL 10μmol/L的正反向引物,0.5μL 5 U的Taq DNA聚合酶,3μL DNA模板(約30 ng),雙蒸水補足50μL。PCR反應(yīng)條件為,94℃130 s預(yù)變性,然后35個循環(huán)的94℃30 s變性,56℃45 s退火,72℃130 s延伸,最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳進行初步分析。

1.2.3 DGGE電泳

(1)變性膠的制備 聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%,變性劑梯度范圍是25%～60%(100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺混合物),變性劑濃度從上向下依次遞增。

(2)加樣 膠經(jīng)1 h凝固后,移去梳子,將膠板移入已盛有60℃預(yù)熱的1×TAE(40 mmol/LTris,20 mmol/L冰醋酸,1 mmol/L EDTA,p H=7.4)電泳緩沖液的電泳槽,電泳緩沖液清洗加樣孔。加入實驗室培養(yǎng)的微藻PCR反應(yīng)混合物15μL(約3 000 ng),或加入海水樣PCR反應(yīng)混合物40μL(約12 000 ng)。(3)電泳及染色 采用Bio-Rad公司DcodeTM基因突變檢測系統(tǒng)進行。在60℃恒定溫度,100 V恒壓下電泳15 h。電泳結(jié)束后剝膠,凝膠在0.4μg/mL的EB染色緩沖液中染色20～30 min[15],蒸餾水中脫色3 min。

1.2.4 觀察及分析 用JS-380A自動凝膠圖像分析儀觀察電泳結(jié)果并拍照。用Quantity One軟件分析條帶數(shù)目及相對光密度,進行各月份條帶數(shù)目的相似性分析。計算各月份的真核浮游生物多樣性的香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon index)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取基因組DNA純化及完整性檢測

收集的海水樣品中含有成分復(fù)雜的雜質(zhì),這些雜質(zhì)都會不同程度影響DNA的提取效率和純度,從而影響后續(xù)的PCR-DGGE分析。本研究在DNA提取過程中加入聚維酮(PVP),蛋白酶K及醋酸鉀,通過分析提取DNA在260,280和230 nm的吸光值,結(jié)果表明(見表1),提取DNA的260/280值在1.6～1.8之間,260/230值在1.8～2.5之間。利用引物從培養(yǎng)微藻及海水樣品(見圖1)提取的總DNA中均擴增到1條片段大小在560 bp左右的擴增產(chǎn)物,無非特異性擴增現(xiàn)象。說明提取DNA的純度可以滿足本研究要求。

表1 9個月份海水樣品DNA純度Table 1 The purity of DNA of nine monthsπmarine samp les

2.2 培養(yǎng)微藻18S rDNA V 1～V 3可變區(qū)序列的DGGE電泳

為了優(yōu)化DGGE電泳條件,本研究先用實驗室培養(yǎng)的9種微藻進行DGGE電泳條件篩選(見圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn),變性劑的濃度范圍是影響DGGE電泳的關(guān)鍵因素,當變性劑濃度范圍過大時,在變性劑低濃度區(qū),擴增片段移動慢,電泳結(jié)束時,大多電泳譜帶多滯留凝膠板上層。而變性劑濃度范圍過窄,導(dǎo)致擴增片段泳動速率過快(均為低濃度變性劑)或過慢(均為高濃度變性劑),最終也不能將堿基差別小的擴增片段完全分開。通過比較,變性劑濃度范圍在30%～48%比較理想。

圖1 9個月海水樣品18S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amp lification of 18S rDNA of nine monthsπmarine samp les

從優(yōu)化的DGGE電泳條件獲得的電泳圖可以看到,9個微藻的擴增片段在凝膠中處于不同位置,并且只有1條主帶。其中,新月菱形藻擴增片段移動距離最小,位于凝膠上部,小亞德里亞共生藻擴增片段移動距離最大,位于凝膠底部,小新月菱形藻和新月菱形藻移動距離,處于比較接近位置,其它7種藻均位于凝膠的不同位置,根據(jù)DGGE電泳結(jié)果可將9種微藻清楚分開。

圖2 9個微藻種的DGGE分離圖譜Fig.2 DGGE fingerp rints of 9 microalgae species

2.3 沙子口養(yǎng)殖海區(qū)9個月的海水樣品18S rDNA V 1～V 3可變區(qū)擴增片段的DGGE指紋圖譜

9個月的海水樣品DGGE電泳結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看到,2008年5月11日采集的樣品電泳譜帶最為豐富,因此,本研究以2008年5月11日海水樣品為標準,用Quantity One軟件對9個海水樣品的DGGE圖譜進行分析(見圖4)。圖中顯示9個月中共有38條譜帶,各個月份的譜帶數(shù)目明顯不同,其中2008年5月11日樣品的譜帶數(shù)為21個,2008年12月15日的樣品為13個,月份間真核浮游生物種類的香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.4632。

在9個月的DGGE電泳譜帶中,13,22和29號條帶在分析的9個月均存在,為共有譜帶,占總譜帶的7.69%,9,20,21和30號在8個月中出現(xiàn)且密度較高,說明這些譜帶顯示的真核浮游生物具有廣泛適應(yīng)性。另外,也存在僅在1個或幾個月份出現(xiàn)的特異性譜帶,如14,31,36和37號分別是2009年1月6日,2008年8月30日,2008年10月10日,2008年2月15日采集水樣的特有譜帶,類似這些具有月份特征性的譜帶數(shù)目為11條,占28.2%。

圖3 9個月份海水樣品DGGE分離圖譜Fig.3 DGGE fingerprints of nine months’marine samples

圖4 DGGE泳道/條帶識別圖Fig.4 Compare lane images

根據(jù)不同月份DGGE電泳譜帶的對比結(jié)果,本研究用戴斯系數(shù)Cs(Dice coefficient)法計算各月份真核浮游生物種類的相似性(見表2),結(jié)果表明相似度最大為2009年3月和4月的樣品,達89.7%,最小為2008年6月和12月的樣品,為38.9%。基于相似性數(shù)據(jù),構(gòu)建UPGMA聚類圖(見圖5),結(jié)果顯示2008年5,6,8月份聚為一大支,2008年12,10月和2009年1,2,4,3月份聚成一大支,顯示月份相近的樣品浮游生物的種類也較為接近。

表2 沙子口扇貝養(yǎng)殖海區(qū)各月份真核浮游生物相似性Table 2 Similarity of eukaryotic p lankton assemblages of ninemonths at the culture scallop area of Shazikou

圖5 沙子口養(yǎng)殖海區(qū)各月份真核浮游生物UPGMA聚類圖Fig.5 UPGMA clustering analysis of eukaryotic plankton assemblages of nine months at the culture scallop area of Shazikou

3 討論

本實驗是對養(yǎng)殖海水中真核浮游生物多樣性研究方法的探討。利用PCR-DGGE技術(shù),基于真核生物核糖體18S rDNA可變區(qū)序列,Beatriz Díez等[14],Marie Lefranc等[16]對海水和湖水中的真核浮游生物種類多樣性進行了分析,認為該技術(shù)可用于水生環(huán)境中浮游生物種類多樣性和豐度的定量分析。在國內(nèi),鮑磊等[8]對海水環(huán)境中的真核浮游生物,陳美軍等[17]對太湖不同湖區(qū)的真核浮游生物,馬曉軍等[11]對不同類型冰川雪坑的真核微生物分別進行了種類多樣性分析,本研究對實驗室純化培養(yǎng)的9種餌料微藻的DGGE分析顯示,該方法可將不同微藻種清楚分開,這些研究一致表明PCR-DGGE技術(shù)用于研究真核微生物群落結(jié)構(gòu)在時間和空間上的動態(tài)變化是可行的。該方法的優(yōu)點是可對采自不同環(huán)境的大量樣品進行快速的分析,DGGE電泳譜帶的數(shù)量和亮度可相應(yīng)反映環(huán)境中微生物種的數(shù)量和優(yōu)勢種群[18],它不僅可對易培養(yǎng)微生物進行分析,也可對不易培養(yǎng)微生物進行研究,與傳統(tǒng)顯微鏡觀察分析方法相比具有顯著的優(yōu)越性。

關(guān)于扇貝攝食餌料種類分析,已有的研究并不多,王如才等[12]的研究表明,櫛孔扇貝的食料以硅藻為主,不同季節(jié)不同地區(qū)扇貝攝食餌料存在很大變化,與養(yǎng)殖海區(qū)浮游生物種群結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。因而研究養(yǎng)殖海區(qū)真核浮游生物的變化對于反映養(yǎng)殖期間貝類的食料變化具有一定意義。通過離心收集水樣中大小在幾微米到上百微米的浮游生物,本研究DGGE分析的結(jié)果表明,不同月份的真核浮游生物種的數(shù)量存在很大的不同,其中5月最多,而12月數(shù)量最少。比較不同月份微生物種類的相似性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相近月份水樣中的真核微生物種類的相似性也最高,其中2008年5,6和8月的種類最為相似,2009年1～4月的種類相似性最高。2008年5月和2009年4月水樣中真核微生物的種類差異較大,可能與采樣時間間隔較長,微生物群落變化較大有關(guān)。因此如要對整個養(yǎng)殖季節(jié)海區(qū)真核生物的種類多樣性進行分析,有必要連續(xù)采樣。本研究的結(jié)果表明,通過PCR擴增真核細胞18S rDNA可變區(qū)序列利用DGGE技術(shù)分析扇貝養(yǎng)殖海區(qū)浮游真核餌料生物的種類和豐度的季節(jié)性變化是可行的。本研究初步的結(jié)果表明,5,6,8月真核微生物種類數(shù)量最為豐富,說明這一時期是扇貝攝取餌料的種類最多,扇貝營養(yǎng)最為全面,因而是最有利扇貝生長的時期。

[1] 羅海峰,齊鴻雁,薛凱,等.在PCR-DGGE研究土壤微生物多樣性中應(yīng)用GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)的效應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)報,2003,23(8):1570-1575.

[2] 王光華,劉俊杰,齊曉寧,等.Biolog和PCR-DGGE技術(shù)解析施肥對德惠黑土細菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].生態(tài)學(xué)報,2008,28(1):220-226.

[3] 趙興青,楊柳燕,陳燦,等.PCR-DGGE技術(shù)用于湖泊沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究[J].生態(tài)學(xué)報,2006,26(11):3610-3616.

[4] 吳利,余育和,張?zhí)昧?等.牛山湖浮游生物群落DNA指紋結(jié)構(gòu)與理化因子的關(guān)系[J].湖泊科學(xué),2008,20(2):235-241.

[5] 黃俊文,馮定遠,林映才.PCR-DGGE技術(shù)及其在動物腸道微生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中國畜牧雜質(zhì),2006,42(17):47-50.

[6] Erik J van Hannen,Gabriel Zwart,Miranda P van Agterveld,et al.Changes in bacterial and eukaryotic community structure after mass lysis of filamentous cyanobacteria associated with viruses[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(2):795-801.

[7] Diez B,Pedros-Alio C,Marsh T L,et al.Application of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)to study the diversity of marine picoeukaryotic assemblages and comparison of DGGE with other molecular techniques[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(7):2942-2951.

[8] 鮑磊,陳紀新,黃邦欽.應(yīng)用變性梯度凝膠電泳研究廈門西海域超微型真核浮游生物多樣性[J].海洋環(huán)境科學(xué),2007,26(6):504-509.

[9] Yan Qingyun,Yu Yuhe,Feng Weisong,et al.Plankton community composition in the three gorges reservoir region revealed by PCR-DGGE and its relationships with environmental factors[J].Journal of Environmental Sciences,2007,20(2008):732-738.

[10] Gast R J,Dennett M R,Caron D A.Characterization of protistan assemblages in the ross Sea,Antarctica,by denaturing gradient gel electrophoresis[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(4):2028-2037.

[11] 馬曉軍,劉煒,侯書貴,等.不同類型冰川雪坑中真核微生物多樣性變化與環(huán)境因子關(guān)系研究[J].自然科學(xué)進展,2008,18(3):254-261.

[12] 王如才,蘭錫祿,劉麗輝,等.櫛孔扇貝的食料分析[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報,1989,S2:43-55.

[13] 楊君,王茜,劉美華,等.一種簡便的海藻DNA提取方法[J].生物技術(shù),9(4):39-42.

[14] Diez B,Pedros-Alio C,Marsh T L,et al.Application of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)to study the diversity of marine picoeukaryotic assemblages and comparison of DGGE with other molecular techniques[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(7):2942-2951.

[15] Yu Z,Morrison M.Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerp ring of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(8):4800-4806.

[16] Marie Lefranc,Aurelie Thenot,Cecile Lepere,et al.Genetic diversity of small eukaryotes in lakes differing by their trophic status[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(10):5935-5942.

[17] 陳美軍,孔繁翔,陳非洲,等.太湖不同湖區(qū)真核微型浮游生物基因多樣性的研究[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(3):769-775.

[18] Fromin N,Hamelin J,Tarnawaski S,et al.Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis(DGGE)fingerp rinting patterns[J].Environmental Microbiology,2002,4(11):634-643.

Diversity of Eukaryotic Plankton Assemblages at Culture Area fo r Scallop by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)

WANG Na1,CA I Yu-Yong1,2,LI Yun1,WANG Chong-Ming2,CU IHong3
(1.The Key Lab of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Academy of Fisheries Sciences,Qingdao 266071,China;3.Center of Farming Detection of Weifang,Weifang 261061,China)

The 18S rRNA genes(V 1 to V 3 region)was amp lified by two universal primers(Euk516r-GC and Euk1A)from 9 cultured microalgae species.Then,the denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)with denaturing gradient of 25%to 65%urea were optimized.The result indicated that the primer sets gave a single band with the length of amplified fragment approximately 560 bp,and the DGGE with denaturing gradient of 35%to 48%urea could separated nine cultured microalgae species in different position.The diversity of eukaryotic planktons from scallop cultivation area was analyzed by DGGE,and total 38 electropho ric bands were showed from the 9 months water collected from 2 meters deep,of which 3 bands existed in all nine months,taking 7.69 percent of total bands number,and there were 11 characteristic bands in different month,taking 28.2 percent.The result indicated that the diversity of eukaryotic planktons was various significantly among different months,Shannon index is 0.4632.Similarity analysis showed that the highest similarity was 89.2%between M arch and April 2009.UPGMA clustering analysis based on different eukaryotic plankton assemblages showed that May,June and August of 2008 were grouped into a clad,January,February,March,April of 2009 into the other clad,which implied that similarity of the eukaryotic plankton diversity among close month was high.

PCR-DGGE;18S r DNA;eukarytic plankton diversity

S917.1

A

1672-5174(2010)12-051-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2006AA 100307);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(nycytx-4)資助

2009-07-13;

2010-05-20

王 娜(1983-),女,碩士,主要從事水產(chǎn)病害學(xué)研究.E-mail:www-wangna@163.com

**通訊作者:E-mail:sxsdlw l@ouc.edu.cn

責任編輯 于 衛(wèi)