液相色譜三級(jí)四極桿質(zhì)譜法快速測(cè)定動(dòng)物組織中維吉霉素M1殘留量

陳小霞,岳振峰,葉衛(wèi)翔,趙鳳娟,饒麗,葛麗雅,歐陽姍

1(深圳大學(xué)教務(wù)處,廣東深圳,518060) 2(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東深圳,518067)

維吉霉素 (Virginiamycin),別名維吉尼亞霉素、維吉尼霉素、肥大霉素等。維吉霉素是美國(guó)史克藥廠畜禽保健公司對(duì)鏈球菌發(fā)酵提取的抗生素。它由70%大環(huán)內(nèi)酯 (M1)(圖 1)和 30%環(huán)狀多肽 (S1)(圖2)混合組成。兩者結(jié)構(gòu)不同,抗菌范圍也不同。維吉霉素的作用主要是抑制細(xì)菌的核糖體(Ribosome),從而阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而達(dá)到殺菌效果。維吉霉素可用于防治畜禽細(xì)菌性痢疾和雞壞死性腸炎,改善飼料的利用率,促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng),已被廣泛使用。但這類藥物也存在一定的副作用,存在著潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)、美國(guó)、日本均規(guī)定了動(dòng)物組織中維吉霉素的最高殘留限量,其中以日本的限量規(guī)定最為全面和嚴(yán)格;歐盟則禁止維吉霉素作為飼料添加藥物使用。維吉霉素在動(dòng)物組織中主要以原形藥物狀態(tài)存在。目前各國(guó)法規(guī)中沒有明確規(guī)定維吉霉素的殘留標(biāo)識(shí)物,但由于 M1為主要成分,國(guó)內(nèi)外普遍將維吉霉素M1作為維吉霉素的殘留標(biāo)識(shí)物。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于動(dòng)物源性食品中維吉霉素藥物殘留的檢測(cè)方法研究報(bào)道均較少[1-13],方法包括瓊脂擴(kuò)散法[1]、酶聯(lián)免疫法[2]、薄層色譜法與生物自顯影聯(lián)用法[3-4]、高效液相色譜法[5-10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11-13],其中 GB/T 20765—2006規(guī)定了豬肝臟、腎臟、肌肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的測(cè)定方法,但該方法的線性范圍未包括國(guó)內(nèi)外的限量規(guī)定濃度,而且需要繁瑣的固相萃取步驟,效率低下。本文采用乙腈脫蛋白同時(shí)提取目標(biāo)物,水稀釋,再利用液質(zhì)聯(lián)用法的選擇性較高和抗干擾能力較強(qiáng)的特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物組織樣品中維吉霉素殘留的快速測(cè)定和確證。

圖 1 維吉霉素M1的分子結(jié)構(gòu)

圖 2 維吉霉素 S1的分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API3000型三級(jí)四極桿質(zhì)譜儀 (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),配電噴霧離子源和 Agilent 1100型液相色譜儀;MinishakerMS1型漩渦混合器 (美國(guó) IKA公司);PT3000型均質(zhì)器 (德國(guó) Brinkmann公司);Turbo LV型吹氮濃縮儀 (美國(guó) Zymark公司);Universal 32型低溫離心機(jī) (德國(guó) Hettich公司);KQ-50B型超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)等。

維吉霉素M1(Sigma公司,純度約 95%);乙腈和甲酸均為色譜純?cè)噭?其他均為分析純?cè)噭?水為超純水。

雞肉、雞肝、雞腎、豬腎和牛腎等動(dòng)物組織樣品均為市購(gòu)。

1.2 樣品處理

稱取試樣 1 g(精確到 0.01 g),置于 15 mL具塞聚丙烯離心管中,加入 3 mL乙腈,旋渦混合 1 min,冰水浴超聲提取 5min。以 3 000 r/min的轉(zhuǎn)速在 15℃下離心 5 min,收集上清液于具有刻度的離心管中。離心后的殘?jiān)?2 mL乙腈重復(fù)上述提取步驟 1次,合并上清液,用水稀釋定容至 10mL,混勻。加入 4mL正己烷,混合 1min,3 000 r/min 5-15℃離心 5 min,棄去正己烷層,下層溶液過 0.22 μm濾膜后供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

Y MC-Pack Pro C18色譜柱 (3μm,100 mm ×2.0 mm i.d.);流速:0.3 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相為乙腈和 0.003 mol/L甲酸銨緩沖液,洗脫梯度:乙腈的比例在 1.0min內(nèi)由 30%線性提高到70%,保持 4.0min,柱平衡時(shí)間 5 min。

ESI+離子化模式;質(zhì)譜分辨率:單位質(zhì)量分辨率;監(jiān)測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM);霧化氣:5.0 L/min;氣簾氣:12.0 L/min;噴霧電壓:4.5 kV;去簇電壓 (DP):50 V;聚焦電壓 (FP):270 V;射人電壓(EP):10 V;去溶劑溫度:550℃;去溶劑氣流:7.0 L/min;碰撞氣 N2:6.0 L/min。其他條件見表 1。

表 1 維吉霉素M1的保留時(shí)間和優(yōu)化質(zhì)譜條件(帶“＊”號(hào)者為定量離子)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用 10 mg/L的待測(cè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式在正離子模式下進(jìn)行全掃描,確定分子離子,然后以待測(cè)化合物的分子離子為母離子,進(jìn)行子離子掃描。選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的 2個(gè)子離子為定性離子。最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)正離子模式優(yōu)化去簇電壓 (DP)、聚焦電壓 (FP)、射人電壓(EP)、碰撞能量 (CE)、碰撞室射出電壓 (CXP)、霧化氣 (NEB)、氣簾氣 (CUR)、碰撞氣 (CAD)、噴霧電壓(IS)、離子化溫度 (TEM)等各種質(zhì)譜參數(shù),得到最佳質(zhì)譜條件 (表 1)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

因維吉霉素M1分子結(jié)構(gòu)中有多個(gè)氨基和羥基,能在水中發(fā)生解離,色譜柱固定相表面的殘存硅醇基和金屬離子可通過氫鍵或離子交換作用對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)烈吸附作用,出現(xiàn)色譜峰拖尾、保留時(shí)間不穩(wěn)定或過長(zhǎng),甚至被保留在色譜柱上,導(dǎo)致峰形異常和分離度下降。本研究采用以高純硅膠為基體并經(jīng)端基封閉處理的 Y MC-Pack Pro C18柱進(jìn)行了分離試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該柱對(duì)維吉霉素和干擾成分具有良好的分離效果和對(duì)稱的峰形,可滿足質(zhì)譜檢測(cè)的要求。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) G B/T 20765—2006采用甲醇 +乙腈 (50+50)與 0.003mol/L甲酸銨緩沖液作為流動(dòng)相,需要 35 min才能完成檢測(cè)。本方法用乙腈代替甲醇 +乙腈(50+50),通過梯度優(yōu)化,可將檢測(cè)時(shí)間縮短到 10min,大幅提高了檢測(cè)效率,而且峰形尖銳對(duì)稱 (圖 3)。

圖 3 加標(biāo)雞肉樣品中維吉霉素M1的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖 (加標(biāo)濃度 25μg/kg)

2.3 提取和凈化條件的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的提取溶劑主要有:甲醇 +磷酸氫二銨[5]、甲醇[6]、甲醇 +乙腈[7,12]、乙酸乙酯[9,11]、乙腈[13]等,本方法經(jīng)比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),直接采用乙腈超聲提取不僅可以減少脂肪等雜質(zhì)的提出,而且回收率較高。文獻(xiàn)報(bào)道的凈化方法包括 C18固相萃取凈化[1-3]、硅膠 +HLB固相萃取凈化[4]等。本文經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),樣品提取液經(jīng)水稀釋后用正己烷凈化,即可達(dá)到凈化要求,不僅避免了煩瑣的固相萃取凈化步驟,而且降低了檢測(cè)成本,提高了檢測(cè)效率。

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

大氣壓噴霧電離離子源 (ESI)容易受樣品基質(zhì)的影響,但通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值不存在顯著差異,因此維吉霉素M1不存在樣品基質(zhì)效應(yīng)或樣品基質(zhì)效應(yīng)不顯著。

2.5 方法的線性關(guān)系和定量低限

在本檢驗(yàn)方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下,取一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積 (Y軸)對(duì)相應(yīng)的維吉霉素M1的濃度 (X軸)作圖,結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積在 2-50μg/L內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為Y=2.96×103x+2.27×103,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn),確定本方法的定量低限為:雞肉 25μg/kg、雞肝 100μg/kg、雞腎 100μg/kg、牛腎 100μg/kg、豬腎150μg/kg。

2.6 方法的回收率與精密度

以不含維吉霉素M1殘留的動(dòng)物組織為空白樣品基質(zhì),綜合考慮中國(guó)、美國(guó)、日本以及中國(guó)香港的最大殘留限量規(guī)定,按照表 2進(jìn)行 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平進(jìn)行 10次重復(fù)試驗(yàn),測(cè)得維吉霉素的回收率和精密度匯總于表 3。本方法的回收率范圍為:雞肉 86.8%-108%、雞肝 81.8%-109%、雞腎 85.5%-102%、豬腎 82.7%-102%、牛腎 80.7%-103%,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為:雞肉4.3% -6.7%、雞肝 3.3%-7.3%、雞腎 2.8%-4.6%、豬腎 1.9%-4.1%、牛腎 3.4%-6.9%,符合國(guó)內(nèi)外對(duì)殘留分析的要求。

表 2 不同樣品基質(zhì)中維吉霉素M1的添加水平 μg/kg

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法分別檢測(cè)雞肉、雞肝、雞腎、豬腎和牛腎樣品各 20批,檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況匯總于表 4?？梢?除豬腎和雞肉樣品各檢出 1例不合格樣品外,其他樣品均合格。該方法具有靈敏高、選擇性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),方法的各項(xiàng)性能指標(biāo)滿足國(guó)內(nèi)外食品安全法規(guī)的要求,可用于動(dòng)物組織樣品中維吉霉素M1殘留的快速確證檢測(cè)。

表 4 動(dòng)物組織樣品中維吉霉素M1殘留的實(shí)際樣品檢測(cè)情況匯總表

[1] TsaiC E,Kondo F.I mproved agar diffusionmethod for detecting residual antimicrobial agents[J].Journal of Food Protection,2001,64(3):361-366.

[2] Situ C,Elliott C T.Simultaneous and rapid detection of five banned antibiotic growth promoters by immunoassay[J].Analytica Chimica Acta,2005,529(1/2):89-96.

[3] VincentU,Gizzi G,von Holst C,et al.Validation of an analyticalmethod for the determination of spiramycin,virginiamycin and tylosin in feeding-stuffs by thin-layer chromatography and bio-autography[J].Food Additives&Contaminants,2007,24(4):351-359.

[4] Gafner JL.Identification and semiquantitative estimation of antibiotics added to complete feeds,premixes,and concentrates[J].Journal ofAOAC International,1999,82(1):1-8.

[5] 耿志明,陳明,許大光,等.高效液相色譜法測(cè)定雞組織中維吉尼亞霉素 M1的殘留 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,21(3):172-175.

[6] 耿志明,陳明.高效液相色譜法測(cè)定飼料中維吉尼亞霉素M1的殘留[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,21(2):127-130.

[7] 耿志明,陳明,許大光,等.高效液相色譜法測(cè)定豬組織中維吉尼亞霉素 M1的殘留 [J].中國(guó)獸藥雜志,2005,39(2):10-13.

[8] Samanidou V F,Evaggelopoulou E N.Chromatographic analysis of banned antibacterial growth promoters in animal feed[J].Journal of Separation Science,2008,31(11):2 091-2 112.

[9] ChrisA J Hajee,Hans J A van Rhijn,Johan J P Lasaroma,et al.Development and validation of a method for the determination of sub-additive levels of virginiamycin in compound animal feeds by liquid chromatography[J].The Analyst,2001,126(8):1 332-1 338.

[10] Boulaire S,Bauduret J C,Andre F,et al.Veterinary drug residues survey in meat:an HPLC method with a matrix solid phase dispersion extraction[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1997,45(6):2 134-2 142.

[11] 豬肝臟、腎臟、肌肉組織中維吉尼霉素M1殘留量測(cè)定方法 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法 [S].GB/T 20765-2006.

[12] Boison J,Lee S,Gedir R.Analytical determination of virginiamycin drug residues in edible porcine tissues by LC-MSwith confirmation byLC-MS/MS[J].Journal ofAOAC International,2009,92(1):329-339.

[13] DellaW M Sin,Clare Ho,Wong Y C,et al.Simultaneous determination of lincomycin and virginiamycin M1in swine muscle,liver and kidney by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2004,517(1-2):39-45.