李成龍，屠偉峰，張 偉，陳曉東

1.廣東省第二中醫(yī)院麻醉科(廣東 廣州 510095) 2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院全軍臨床麻醉中心(廣東 廣州 510010) 3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科(廣東 廣州 510010)

阿片肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道中廣泛存在的一種重要的腦腸肽，它對胃腸道的動(dòng)力、酸分泌、水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等具有多重影響。阿片肽及阿片受體對不同類型的胃粘膜損傷模型有著不同的影響，保護(hù)作用和惡化作用均有報(bào)道[1～6]，這些研究結(jié)果的分歧可能與不同類型模型的胃粘膜損傷機(jī)制的差異有關(guān)系。故本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry, IHC)，對mu-阿片受體(MOR)、kappa-阿片受體(KOR)、delta-阿片受體(DOR)在大鼠胃組織的分布進(jìn)行定位分析，探討阿片受體在胃發(fā)揮各種生物學(xué)功能及胃粘膜的損傷、修復(fù)與再生中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器主要試劑 兔抗MOR多克隆抗體(Chemicon公司，美國)，兔抗DOR多克隆抗體(Chemicon公司，美國)，兔抗KOR多克隆抗體(Santa cruz公司，美國)，SP試劑盒(廣州深達(dá)生物公司)。主要儀器CS-Ⅵ型攤片烤片機(jī)(孝感巿宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，BM-Ⅶ生物組織包埋機(jī)(孝感巿宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，石蠟切片機(jī)(廣州錦繡儀器公司)，顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.2動(dòng)物選擇成年雄性Wistar大鼠24只，16～20周，體質(zhì)量200±20 g，南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物取材 采用頸椎脫臼法處死大鼠，打開腹腔，暴露胃。用細(xì)線結(jié)扎賁門與幽門，取胃， 4%多聚甲醛5 ml胃腔注射。10 min后，沿胃大彎剪開平鋪，用冰鹽水沖洗胃腔，剪取胃竇、胃體等處胃組織，大小約為1 cm×1 cm，4%多聚甲醛固定8 h，石蠟包埋備用。

1.3.2 免疫組化染色 切片；蠟筆畫圈；常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水；檸檬酸(pH7.4～7.6)高溫抗原修復(fù)20 min；30 ml/L H2O2孵育20 min；滴加1% Triton X-100封閉30 min；滴加一抗(稀釋度1∶500)并4℃過夜；滴加二抗(稀釋度1∶1500)，室溫下孵育60 min；滴加辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的鏈酶卵白素，室溫下孵育10 min；每步驟后均經(jīng)0.01 M PBS沖洗5 min×3次；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。用PBS液代替一抗做陰性對照，步驟同前。

2 結(jié)果

2.1阿片受體在胃組織各部位的陽性反應(yīng)程度見表1。

2.2正常胃組織HE染色圖A為胃粘膜層(HE×200)，黑色箭頭部分為胃粘膜粘液層及上皮層；圖1B為胃粘膜腺體區(qū)(HE×200)，黑色箭頭部分為壁細(xì)胞，光鏡下可見壁細(xì)胞，細(xì)胞膜邊界明顯，胞漿呈嗜酸性，HE染色呈淡紅色，壁細(xì)胞周圍為主細(xì)胞；圖1C為胃粘膜肌層(HE×400)，肌間神經(jīng)叢分布于縱形肌與橫行肌交界處。黑色箭頭部分為肌間神經(jīng)叢，光鏡下神經(jīng)元細(xì)胞核大而不規(guī)則，可見核仁。圖1見封三。

表1 胃組織μ-、δ-、κ-阿片受體陽性反應(yīng)顆粒的分布

注：-陰性反應(yīng)，+輕度陽性反應(yīng)，++中度陽性反應(yīng)，+++重度陽性反應(yīng)

2.3 mu-阿片受體在胃組織的分布MOR免疫反應(yīng)陽性棕色顆粒主要分布于胃粘膜粘液層及上皮細(xì)胞層(圖2A圖黑色箭頭)、胃主細(xì)胞的胞膜及胞漿(圖2B圖黑色箭頭)、胃粘膜下肌間神經(jīng)叢(圖2C圖黑色箭頭，圖2見封三。)。

2.4 kappa-阿片受體在胃組織的分布KOR免疫反應(yīng)陽性棕色顆粒主要分布于胃主細(xì)胞的胞膜及胞漿(圖3B圖黑色箭頭)、胃粘膜下肌間神經(jīng)叢(圖3C圖黑色箭頭)，而胃粘膜粘液層及上皮細(xì)胞層KOR免疫反應(yīng)呈陰性。圖3見封三。

2.5 delta-阿片受體在胃組織的分布DOR免疫反應(yīng)陽性棕色顆粒主要分布于胃主細(xì)胞的胞膜及胞漿(圖4B圖黑色箭頭)、胃粘膜下肌間神經(jīng)叢(圖4C圖黑色箭頭)，而胃粘膜粘液層及上皮細(xì)胞層DOR免疫反應(yīng)呈陰性。圖4見封三。

3 討論

阿片肽與阿片受體作用可引起細(xì)胞膜的超極化和降低膽堿能快興奮性突觸后電位的幅度，通過阻斷動(dòng)作電位的傳導(dǎo)或引起突觸前抑制以減少Ach的釋放。阿片肽對胃腸道功能有多重影響，如胃腸動(dòng)力、酸分泌、水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。然而，阿片類藥物及阿片肽對不同類型的胃粘膜損傷有著不同的影響，保護(hù)作用和惡化作用均有報(bào)道[1～6]，這表明阿片肽及阿片類藥物對胃黏膜的保護(hù)與損害作用取決于阿片受體在胃組織各層功能細(xì)胞上的分布及其阿片肽對胃組織細(xì)胞功能的影響。

本研究顯示，mu-阿片受體陽性顆粒主要分布于胃黏膜上皮及黏液層、胃主細(xì)胞、肌間神經(jīng)叢這些區(qū)域，且主要表達(dá)在胞漿和胞膜，這似乎表明阿片肽可以通過阿片受體抑制胃黏膜表層黏液的分泌、抑制胃蛋白酶的分泌、影響胃平滑肌的緊張性和收縮頻率。Del Tacca M[2]等人的研究發(fā)現(xiàn)，腹腔給予morphine能劑量依賴性抑制胃分泌液的容量、酸度、胃蛋白酶的產(chǎn)量和胃結(jié)合粘蛋白數(shù)量，而morphine對胃潰瘍的影響是非劑量依賴性的，腹腔5 mg/kg的劑量能顯著增加胃損害，腹腔給予Naloxone能預(yù)防m(xù)orphine對胃分泌液的容量、酸度、胃蛋白酶產(chǎn)量的影響，但對為粘液和潰瘍評(píng)分沒有影響，腦室給予morphine能劑量依賴性抑制胃分泌液的容量、酸度和胃潰瘍評(píng)分，而對胃粘液沒有影響，腦室給予Naloxone則能預(yù)防m(xù)orphine上述效應(yīng)，這些研究結(jié)果表明morphine對胃分泌抑制效應(yīng)是通過中樞和外周機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的，而對粘液的影響則是通過外周阿片受體作用來抑制其合成，并且屏障粘液合成的抑制可能部分參與了morphine致潰瘍作用。然而，Tazi-Saad & Del Tacca等[3]人的研究結(jié)果則得出上述相反的結(jié)果。他們研究了morphine對indomethacin、aspirin、taurocholic acid 三種藥物復(fù)制的大鼠胃潰瘍動(dòng)物模型幽門結(jié)扎后胃分泌、粘液屏障、粘摸損傷的影響。結(jié)果顯示：三種致潰瘍藥物誘導(dǎo)明顯的胃粘膜損傷，morphine減少胃酸分泌并抑制aspirin、taurocholic acid誘導(dǎo)的粘膜損傷，對indomethacin誘導(dǎo)的損傷沒有影響，提示indomethacin與aspirin 、taurocholic acid致潰瘍機(jī)制不同，而且morphine是通過增加粘液屏障的厚度來發(fā)揮抗?jié)冏饔玫?，且增加的厚度值與它的保護(hù)效應(yīng)正相關(guān)，其保護(hù)效應(yīng)能被naloxone逆轉(zhuǎn)。由此可見，mu-阿片受體在胃組織各功能細(xì)胞的分布決定了它的生理功能，并與細(xì)胞的所處的功能狀態(tài)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)delta-與kappa-阿片受體在胃黏膜上皮及黏液層沒有陽性顆粒的表達(dá)，只分布于胃主細(xì)胞、肌間神經(jīng)叢這些區(qū)域。delta-與kappa-阿片受體對胃腸道功能影響的研究尚不多見，Gyires K等[1]人2001年研究了δ阿片受體選擇性激動(dòng)劑DADLE、DPDPE、deltorphin II和mu-受體選擇性激動(dòng)劑DAGO對乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周delta-和mu-阿片受體介導(dǎo)胃粘膜保護(hù)，阿片受體胃粘膜保護(hù)作用需要迷走神經(jīng)完整性，NO和PGs參與了阿片受體介導(dǎo)的胃保護(hù)。我們的前期研究結(jié)果也表明，舒芬太尼可通過抗氧自由基機(jī)制對大鼠急性胃黏膜病變發(fā)生保護(hù)作用，其可能與delta-、kappa-阿片受體有關(guān)[7]。delta-與kappa-阿片受體在胃腸道中的生理功能及相互之間的作用需進(jìn)一步深入研究。

在本實(shí)驗(yàn)中值得注意的是，mu-、delta-、kappa-三種阿片受體在黏膜下神經(jīng)叢為陰性表達(dá)。黏膜下神經(jīng)叢支配黏膜下血管，而黏膜下血管的收縮影響胃黏膜血流量(GMBF)，而GMBF是胃黏膜保護(hù)與損傷重要的調(diào)控靶點(diǎn)之一。近年來，本研究領(lǐng)域鮮有阿片類藥物對GMBF影響的文獻(xiàn)報(bào)道，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎可以看出mu-、delta-、kappa-三種阿片受體對GMBF沒有直接影響，它們可能通過對組織局部NO和PGs含量的影響來間接調(diào)節(jié)GMBF，但阿片肽對NO和PGs組織含量的影響機(jī)制尚不明了。

總之，mu-、kappa-、delta-阿片受體在胃主細(xì)胞膜和胞漿、肌間神經(jīng)叢等部位均有分布，但僅mu-阿片受體存在于胃黏膜上皮及黏液層，提示阿片受體參與了胃各種生物學(xué)功能及胃粘膜的損傷、修復(fù)與再生，其確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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