靳存敬,史繼云,劉 妍,靳曉娜,黃金銘,趙慧云,李 方,王 凡,*
1.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)同位素研究中心,北京 100191;2.北京協(xié)和醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,北京 100730
實(shí)體腫瘤生長過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是新生血管生成(angiogenesis)[1]。在諸多針對(duì)血管為靶點(diǎn)的腫瘤治療中,整合素(integrin)αvβ3受到廣泛的關(guān)注,它在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面和多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織器官不表達(dá)或表達(dá)很低,并且在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移、生長、分化過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。整合素αvβ3能識(shí)別配體分子中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列,因此為設(shè)計(jì)含有RGD序列的多肽藥物用于整合素αvβ3陽性腫瘤的檢測和治療提供了理論基礎(chǔ)[5-6]。
放射性核素標(biāo)記的RGD多肽已廣泛用于腫瘤的顯像和治療研究[7-8]。為了增加RGD多肽與整合素αvβ3的親和力,人們將“多聚化”的概念引入到RGD多肽放射性藥物的研究中[9-10]。另外,為了改善放射性藥物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì),人們對(duì)標(biāo)記藥物進(jìn)行修飾,包括糖基化、引入水溶性的氨基酸和聚乙二醇(PEG)[7]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中也對(duì)有關(guān)RGD多肽多聚化以及結(jié)構(gòu)修飾方面的工作進(jìn)行了報(bào)道[11-16]。
本研究以HYNIC為雙功能螯合劑,用99Tcm標(biāo)記PEG4修飾的2種RGD二聚體衍生物:在2個(gè)RGD模序(motif)間引入2個(gè)PEG4分子;在RGD二聚體與HYNIC雙功能螯合劑間引入1個(gè)PEG4分子(圖1),比較在不同部位引入PEG4分子對(duì)受體配體親和力的影響,以及對(duì)標(biāo)記藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響,并對(duì)其在正常鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖1 RGD環(huán)肽二聚體及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of cyclic RGD dimer and its derivatives
Na99TcmO4,北京原子高科核技術(shù)股份有限公司;HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer,結(jié)構(gòu)示于圖1,美國Purdue大學(xué)劉爽教授饋贈(zèng);三羥甲基甘氨酸(Tricine,N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)、三苯基膦三間磺酸鈉(TPPTS,trisodium triphenylphosphine-3,3′,3″-trisulfonate),美國SIGMA公司;丙酮、乙腈、醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸等,分析純,北京試劑公司;快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG),美國Gelman公司。96孔細(xì)胞抽濾板,美國Millipore公司。
CRC-15R放射性活度計(jì),美國Capintec公司;1470-002全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀,美國Perkin Elmer公司;AR-2000 放射性薄層掃描儀,美國Bioscan公司;HP1100高效液相色譜(帶有Berthold公司的LB-509放射性檢測器),美國安捷倫公司;Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),美國安捷倫公司。
ICR小白鼠,雌性,約25 g,二級(jí),購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。
在Eppendorf(EP)管中加入6.50 mg Tricine、5.00 mg TPPTS、20 μL HYNIC偶聯(lián)的不同的RGD多肽(HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer)(1 g/L)、100 μL琥珀酸緩沖溶液(pH=5.0,25 mmol/L),最后加入100 μL Na99TcmO4(約74 MBq),混勻,100 ℃反應(yīng)20 min,取樣進(jìn)行ITLC和HPLC分析。注射前用Sep-Pak C18小柱對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行純化,并過0.22 μm濾膜。
2.2.1薄層層析法(ITLC) 將標(biāo)記物點(diǎn)樣于ITLC濾紙上,于丙酮展開體系中上行展開,用放射性薄層掃描儀進(jìn)行掃描,計(jì)算標(biāo)記率和放化純度。
2.2.2HPLC法 使用LabAlliance HPLC系統(tǒng),配備放射性在線檢測器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm×250 mm,30 nm pore size),梯度淋洗30 min,流速1.0 mL/min,其中流動(dòng)相A為醋酸氨緩沖液(NH4OAc,0.025 mol/L,pH=5.0),B為乙腈,流速為1.0 mL/min,淋洗梯度設(shè)定為起始至2 min時(shí)90% A和10% B,5 min時(shí)85% A和15% B,15 min時(shí)80% A和20% B,20—25 min時(shí)50% A和50% B,26—30 min回到基線梯度90% A和10% B。
將100 μL標(biāo)記物加入到含有400 μL磷酸緩沖溶液(PB,pH=7.4,0.05 mol/L)和500 μL正辛醇的EP管中,蝸旋4 h后在8 000 r/min 條件下離心10 min,取等體積有機(jī)相和水相測量放射性計(jì)數(shù),計(jì)算標(biāo)記物的脂水分配系數(shù)P(有機(jī)相計(jì)數(shù)/水相計(jì)數(shù))及l(fā)gP。
采用Iodogen方法制備125I-c(RGDyK),比活度約為3.7×1013Bq/mmol。U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。參考Chen[17]的方法,制細(xì)胞懸液,并按每孔105個(gè)細(xì)胞鋪于Multiscreen 96孔抽慮板上,加入約2×105/min的125I-c(RGDyK)以及濃度依次遞升的3種RGD多肽(0~1 000 nmol/L),用結(jié)合緩沖液(pH=7.4,500 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,2 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L MnCl2和w=1%的牛血清白蛋白)將反應(yīng)體積調(diào)節(jié)到200 μL,4 ℃孵育2 h,洗去未結(jié)合的125I-c(RGDyK),收集濾膜并在γ計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行測量,用GraphPad Prism 4.0(GraphPad軟件,SanDiego,CA)軟件進(jìn)行擬合,非線性回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。
2.5.1標(biāo)記物的藥代動(dòng)力學(xué) 選取21只ICR小白鼠,隨機(jī)分成3組,每組7只。經(jīng)尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標(biāo)記物,于注射后1、3、5、7、10、15、20、30、60、120 min取尾靜脈血,稱重并測量放射性計(jì)數(shù),經(jīng)衰變校正后計(jì)算每毫升血液的百分注射劑量率Dinj(%ID/mL),繪制血液清除曲線。
2.5.2標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布 將36只ICR小白鼠隨機(jī)分成3組,每組12只,分別經(jīng)尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標(biāo)記物,于注射后0.5、1、4 h按組(每組4只)將實(shí)驗(yàn)小鼠處死,取血及主要臟器,稱重并測量放射性計(jì)數(shù),經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。
使用Prism 4.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P<0.05為有顯著性差異。
在ITLC分析方法中,標(biāo)記化合物的Rf=0.0~0.1,游離99Tcm的Rf=0.9~1.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種標(biāo)記化合物的標(biāo)記率均達(dá)到98%以上。本研究采用TPPTS作為協(xié)同配體,它同時(shí)具有還原作用,因此在標(biāo)記過程中不用加入氯化亞錫,這樣可以防止锝膠體的生成。
純化后3種標(biāo)記物的HPLC分析結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,99Tcm-HYNIC-RGD dimer的保留時(shí)間為10.64 min,99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的保留時(shí)間為10.53 min,99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的保留時(shí)間為11.53 min(游離99Tcm的保留時(shí)間約為3 min),3種標(biāo)記物的放射化學(xué)純度均大于99%。
圖2 3種99Tcm標(biāo)記物的放射性HPLC圖譜Fig.2 Radio-HPLC chromatogram of three 99Tcm-labeled compounds
化合物的脂水分配系數(shù)可以用于評(píng)價(jià)標(biāo)記物的水溶性,脂水分配系數(shù)越大說明標(biāo)記物的脂溶性越好。99Tcm-HYNIC-RGD dimer,99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer和99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的lgP分別為-2.24±0.01(n=3),-2.78±0.04(n=3),-2.52±0.02(n=3)。結(jié)果表明,PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。
通過c(RGDyK)、HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer競爭125I-c(RGDyK)與U87MG細(xì)胞表面整合素αvβ3的結(jié)合,比較了4種配體對(duì)整合素αvβ3的親和力(圖3),它們的IC50值分別為37.29±5.00、8.43±0.62、7.53±0.51、2.90±0.31 nmol/L。IC50值越小,表明親和力越強(qiáng)。HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力約為HYNIC-RGD dimer的2.5倍,約為RGD單體的12倍。HYNIC-PEG4-RGD dimer與HYNIC-RGD dimer相比,親和力無顯著差異。HYNIC-2PEG4-RGD dimer是在2個(gè)RGD模序(motif)之間引入2個(gè)PEG4分子,從而2個(gè)RGD模序之間的距離從6個(gè)化學(xué)鍵長增加到38個(gè)化學(xué)鍵長,這樣2個(gè)RGD分子可以同時(shí)與細(xì)胞表面2個(gè)相鄰的整合素αvβ3受體相結(jié)合,增強(qiáng)了結(jié)合的親和力。這與Wang等[18]的研究結(jié)果相一致。HYNIC-PEG4-RGD dimer是在RGD多肽與雙功能螯合劑HYNIC之間引入1個(gè)PEG4分子,沒有改變2個(gè)RGD模序之間的距離,因此其與整合素αvβ3的親和力沒有明顯改變。
圖3 受體競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Receptor competitive binding assay■——c(RGDyK),▼——HYNIC-RGD dimer,◆——HYNIC-PEG4-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer
3.4.1藥代動(dòng)力學(xué)研究 3種標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的血液清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖4。從圖4可以看出,3者均符合二室代謝模型,其中99Tcm-HYNIC-RGD dimer的分布相為0.76 min,消除相為17.10 min;99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的分布相為0.72 min,消除相為24.23 min;99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的分布相為0.62 min,消除相為14.39 min。3種標(biāo)記物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相似,并都符合多肽類藥物分布清除快的特點(diǎn)。
圖4 3種99Tcm標(biāo)記物的血液清除曲線Fig.4 Blood clearance of three 99Tcm-labeled compounds▲——HYNIC-PEG4-RGD dimer,■——HYNIC-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer
3.4.2藥物在正常鼠體內(nèi)的生物分布 3種標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布數(shù)據(jù)列于表1。從表1可以看到,注射后0.5 h99Tcm-HYNIC-
PEG4-RGD dimer((17.61±1.87)%ID/g)在腎的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((13.85±1.91)%ID/g,P<0.05),其余臟器各標(biāo)記物組別間沒有差異,這表明PEG4作為藥代動(dòng)力學(xué)修飾分子增強(qiáng)了標(biāo)記物的親水性,從而增強(qiáng)了其從腎臟的排泄;注射后4 h腸對(duì)99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer((4.01±0.90)%ID/g)的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((2.12±0.71)%ID/g,P<0.05),我們考慮這是否是由于腸中有整合素αvβ3的表達(dá),2個(gè)PEG4的引入明顯提高了配體受體的親和力,從而增加了腸的攝取,這需要通過Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證;腎對(duì)99Tcm-HYNIC-RGD dimer的攝取低于其余2種標(biāo)記物,這與脂水分配系數(shù)測定結(jié)果相一致,PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。
表1 3種99Tcm標(biāo)記物的正常鼠生物分布Table 1 Biodistribution of three 99Tcm-labeled compounds in normal mice
注(Note):n=4
在本研究中,3種99Tcm標(biāo)記的RGD二聚體在所用標(biāo)記條件下均獲得大于98%的標(biāo)記率;競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力明顯高于其它2種化合物;藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了3種多肽類藥物的代謝特點(diǎn),均有較快的分布相和消除相;正常鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果表明,PEG4的引入增強(qiáng)了標(biāo)記物的水溶性。99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer具有更好的體內(nèi)外性質(zhì),作為一種潛在的腫瘤顯像劑,具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。
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