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      99Tcm標(biāo)記的PEG4/2PEG4修飾的環(huán)狀RGD二聚體體內(nèi)外性質(zhì)的對(duì)比

      2010-01-26 04:07:14靳存敬史繼云靳曉娜黃金銘趙慧云
      核化學(xué)與放射化學(xué) 2010年5期
      關(guān)鍵詞:藥代整合素親和力

      靳存敬,史繼云,劉 妍,靳曉娜,黃金銘,趙慧云,李 方,王 凡,*

      1.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)同位素研究中心,北京 100191;2.北京協(xié)和醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,北京 100730

      實(shí)體腫瘤生長過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是新生血管生成(angiogenesis)[1]。在諸多針對(duì)血管為靶點(diǎn)的腫瘤治療中,整合素(integrin)αvβ3受到廣泛的關(guān)注,它在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面和多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織器官不表達(dá)或表達(dá)很低,并且在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移、生長、分化過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。整合素αvβ3能識(shí)別配體分子中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列,因此為設(shè)計(jì)含有RGD序列的多肽藥物用于整合素αvβ3陽性腫瘤的檢測和治療提供了理論基礎(chǔ)[5-6]。

      放射性核素標(biāo)記的RGD多肽已廣泛用于腫瘤的顯像和治療研究[7-8]。為了增加RGD多肽與整合素αvβ3的親和力,人們將“多聚化”的概念引入到RGD多肽放射性藥物的研究中[9-10]。另外,為了改善放射性藥物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì),人們對(duì)標(biāo)記藥物進(jìn)行修飾,包括糖基化、引入水溶性的氨基酸和聚乙二醇(PEG)[7]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中也對(duì)有關(guān)RGD多肽多聚化以及結(jié)構(gòu)修飾方面的工作進(jìn)行了報(bào)道[11-16]。

      本研究以HYNIC為雙功能螯合劑,用99Tcm標(biāo)記PEG4修飾的2種RGD二聚體衍生物:在2個(gè)RGD模序(motif)間引入2個(gè)PEG4分子;在RGD二聚體與HYNIC雙功能螯合劑間引入1個(gè)PEG4分子(圖1),比較在不同部位引入PEG4分子對(duì)受體配體親和力的影響,以及對(duì)標(biāo)記藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響,并對(duì)其在正常鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行評(píng)價(jià)。

      圖1 RGD環(huán)肽二聚體及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of cyclic RGD dimer and its derivatives

      1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1 主要試劑

      Na99TcmO4,北京原子高科核技術(shù)股份有限公司;HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer,結(jié)構(gòu)示于圖1,美國Purdue大學(xué)劉爽教授饋贈(zèng);三羥甲基甘氨酸(Tricine,N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)、三苯基膦三間磺酸鈉(TPPTS,trisodium triphenylphosphine-3,3′,3″-trisulfonate),美國SIGMA公司;丙酮、乙腈、醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸等,分析純,北京試劑公司;快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG),美國Gelman公司。96孔細(xì)胞抽濾板,美國Millipore公司。

      1.2 儀器

      CRC-15R放射性活度計(jì),美國Capintec公司;1470-002全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀,美國Perkin Elmer公司;AR-2000 放射性薄層掃描儀,美國Bioscan公司;HP1100高效液相色譜(帶有Berthold公司的LB-509放射性檢測器),美國安捷倫公司;Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),美國安捷倫公司。

      1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      ICR小白鼠,雌性,約25 g,二級(jí),購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 3種標(biāo)記化合物的制備

      在Eppendorf(EP)管中加入6.50 mg Tricine、5.00 mg TPPTS、20 μL HYNIC偶聯(lián)的不同的RGD多肽(HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer)(1 g/L)、100 μL琥珀酸緩沖溶液(pH=5.0,25 mmol/L),最后加入100 μL Na99TcmO4(約74 MBq),混勻,100 ℃反應(yīng)20 min,取樣進(jìn)行ITLC和HPLC分析。注射前用Sep-Pak C18小柱對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行純化,并過0.22 μm濾膜。

      2.2 質(zhì)量控制方法

      2.2.1薄層層析法(ITLC) 將標(biāo)記物點(diǎn)樣于ITLC濾紙上,于丙酮展開體系中上行展開,用放射性薄層掃描儀進(jìn)行掃描,計(jì)算標(biāo)記率和放化純度。

      2.2.2HPLC法 使用LabAlliance HPLC系統(tǒng),配備放射性在線檢測器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm×250 mm,30 nm pore size),梯度淋洗30 min,流速1.0 mL/min,其中流動(dòng)相A為醋酸氨緩沖液(NH4OAc,0.025 mol/L,pH=5.0),B為乙腈,流速為1.0 mL/min,淋洗梯度設(shè)定為起始至2 min時(shí)90% A和10% B,5 min時(shí)85% A和15% B,15 min時(shí)80% A和20% B,20—25 min時(shí)50% A和50% B,26—30 min回到基線梯度90% A和10% B。

      2.3 脂水分配系數(shù)的測定

      將100 μL標(biāo)記物加入到含有400 μL磷酸緩沖溶液(PB,pH=7.4,0.05 mol/L)和500 μL正辛醇的EP管中,蝸旋4 h后在8 000 r/min 條件下離心10 min,取等體積有機(jī)相和水相測量放射性計(jì)數(shù),計(jì)算標(biāo)記物的脂水分配系數(shù)P(有機(jī)相計(jì)數(shù)/水相計(jì)數(shù))及l(fā)gP。

      2.4 競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

      采用Iodogen方法制備125I-c(RGDyK),比活度約為3.7×1013Bq/mmol。U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。參考Chen[17]的方法,制細(xì)胞懸液,并按每孔105個(gè)細(xì)胞鋪于Multiscreen 96孔抽慮板上,加入約2×105/min的125I-c(RGDyK)以及濃度依次遞升的3種RGD多肽(0~1 000 nmol/L),用結(jié)合緩沖液(pH=7.4,500 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,2 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L MnCl2和w=1%的牛血清白蛋白)將反應(yīng)體積調(diào)節(jié)到200 μL,4 ℃孵育2 h,洗去未結(jié)合的125I-c(RGDyK),收集濾膜并在γ計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行測量,用GraphPad Prism 4.0(GraphPad軟件,SanDiego,CA)軟件進(jìn)行擬合,非線性回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

      2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

      2.5.1標(biāo)記物的藥代動(dòng)力學(xué) 選取21只ICR小白鼠,隨機(jī)分成3組,每組7只。經(jīng)尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標(biāo)記物,于注射后1、3、5、7、10、15、20、30、60、120 min取尾靜脈血,稱重并測量放射性計(jì)數(shù),經(jīng)衰變校正后計(jì)算每毫升血液的百分注射劑量率Dinj(%ID/mL),繪制血液清除曲線。

      2.5.2標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布 將36只ICR小白鼠隨機(jī)分成3組,每組12只,分別經(jīng)尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標(biāo)記物,于注射后0.5、1、4 h按組(每組4只)將實(shí)驗(yàn)小鼠處死,取血及主要臟器,稱重并測量放射性計(jì)數(shù),經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。

      2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      使用Prism 4.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P<0.05為有顯著性差異。

      3 結(jié)果和討論

      3.1 標(biāo)記物的制備及質(zhì)控

      在ITLC分析方法中,標(biāo)記化合物的Rf=0.0~0.1,游離99Tcm的Rf=0.9~1.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種標(biāo)記化合物的標(biāo)記率均達(dá)到98%以上。本研究采用TPPTS作為協(xié)同配體,它同時(shí)具有還原作用,因此在標(biāo)記過程中不用加入氯化亞錫,這樣可以防止锝膠體的生成。

      純化后3種標(biāo)記物的HPLC分析結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,99Tcm-HYNIC-RGD dimer的保留時(shí)間為10.64 min,99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的保留時(shí)間為10.53 min,99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的保留時(shí)間為11.53 min(游離99Tcm的保留時(shí)間約為3 min),3種標(biāo)記物的放射化學(xué)純度均大于99%。

      圖2 3種99Tcm標(biāo)記物的放射性HPLC圖譜Fig.2 Radio-HPLC chromatogram of three 99Tcm-labeled compounds

      3.2 脂水分配系數(shù)

      化合物的脂水分配系數(shù)可以用于評(píng)價(jià)標(biāo)記物的水溶性,脂水分配系數(shù)越大說明標(biāo)記物的脂溶性越好。99Tcm-HYNIC-RGD dimer,99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer和99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的lgP分別為-2.24±0.01(n=3),-2.78±0.04(n=3),-2.52±0.02(n=3)。結(jié)果表明,PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。

      3.3 競爭結(jié)合研究

      通過c(RGDyK)、HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer競爭125I-c(RGDyK)與U87MG細(xì)胞表面整合素αvβ3的結(jié)合,比較了4種配體對(duì)整合素αvβ3的親和力(圖3),它們的IC50值分別為37.29±5.00、8.43±0.62、7.53±0.51、2.90±0.31 nmol/L。IC50值越小,表明親和力越強(qiáng)。HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力約為HYNIC-RGD dimer的2.5倍,約為RGD單體的12倍。HYNIC-PEG4-RGD dimer與HYNIC-RGD dimer相比,親和力無顯著差異。HYNIC-2PEG4-RGD dimer是在2個(gè)RGD模序(motif)之間引入2個(gè)PEG4分子,從而2個(gè)RGD模序之間的距離從6個(gè)化學(xué)鍵長增加到38個(gè)化學(xué)鍵長,這樣2個(gè)RGD分子可以同時(shí)與細(xì)胞表面2個(gè)相鄰的整合素αvβ3受體相結(jié)合,增強(qiáng)了結(jié)合的親和力。這與Wang等[18]的研究結(jié)果相一致。HYNIC-PEG4-RGD dimer是在RGD多肽與雙功能螯合劑HYNIC之間引入1個(gè)PEG4分子,沒有改變2個(gè)RGD模序之間的距離,因此其與整合素αvβ3的親和力沒有明顯改變。

      圖3 受體競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Receptor competitive binding assay■——c(RGDyK),▼——HYNIC-RGD dimer,◆——HYNIC-PEG4-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

      3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

      3.4.1藥代動(dòng)力學(xué)研究 3種標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的血液清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖4。從圖4可以看出,3者均符合二室代謝模型,其中99Tcm-HYNIC-RGD dimer的分布相為0.76 min,消除相為17.10 min;99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的分布相為0.72 min,消除相為24.23 min;99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的分布相為0.62 min,消除相為14.39 min。3種標(biāo)記物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相似,并都符合多肽類藥物分布清除快的特點(diǎn)。

      圖4 3種99Tcm標(biāo)記物的血液清除曲線Fig.4 Blood clearance of three 99Tcm-labeled compounds▲——HYNIC-PEG4-RGD dimer,■——HYNIC-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

      3.4.2藥物在正常鼠體內(nèi)的生物分布 3種標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布數(shù)據(jù)列于表1。從表1可以看到,注射后0.5 h99Tcm-HYNIC-

      PEG4-RGD dimer((17.61±1.87)%ID/g)在腎的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((13.85±1.91)%ID/g,P<0.05),其余臟器各標(biāo)記物組別間沒有差異,這表明PEG4作為藥代動(dòng)力學(xué)修飾分子增強(qiáng)了標(biāo)記物的親水性,從而增強(qiáng)了其從腎臟的排泄;注射后4 h腸對(duì)99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer((4.01±0.90)%ID/g)的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((2.12±0.71)%ID/g,P<0.05),我們考慮這是否是由于腸中有整合素αvβ3的表達(dá),2個(gè)PEG4的引入明顯提高了配體受體的親和力,從而增加了腸的攝取,這需要通過Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證;腎對(duì)99Tcm-HYNIC-RGD dimer的攝取低于其余2種標(biāo)記物,這與脂水分配系數(shù)測定結(jié)果相一致,PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。

      表1 3種99Tcm標(biāo)記物的正常鼠生物分布Table 1 Biodistribution of three 99Tcm-labeled compounds in normal mice

      注(Note):n=4

      4 結(jié) 論

      在本研究中,3種99Tcm標(biāo)記的RGD二聚體在所用標(biāo)記條件下均獲得大于98%的標(biāo)記率;競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力明顯高于其它2種化合物;藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了3種多肽類藥物的代謝特點(diǎn),均有較快的分布相和消除相;正常鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果表明,PEG4的引入增強(qiáng)了標(biāo)記物的水溶性。99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer具有更好的體內(nèi)外性質(zhì),作為一種潛在的腫瘤顯像劑,具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

      [1] Fukumura D, Jain R K. Imaging Angiogenesis and the Microenvironment[J]. APMIS, 2008, 116 (7-8): 695-715.

      [2] Zitzmann S, Ehemann V, Schwab M. Arginine-Glycine-Aspartic Acid (RGD)-Peptide Binds to Both Tumor and Tumor Endothelial CellsinVivo[J]. Cancer Res, 2002, 62(18): 5 139-5 143.

      [3] Hynes R O, Lively J C, Mccarty J H, et al. The Diverse Roles of Integrins and Their Ligands in Angiogenesis[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2002, 67: 143-153.

      [4] Ruoslahti E. Specialization of Tumour Vasculature[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(2): 83-90.

      [5] Ruoslahti E, Pierschbacher M D. New Perspectives in Cell Adhesion: RGD and Integrins[J]. Science, 1987, 238(4 826): 491-497.

      [6] Haubner R, Finsinger D, Kessler H. Stereoisomeric Peptide Libraries and Peptidomimetics for Design-ing Selective Inhibitors of the αvβ3Integrin for a New Cancer Therapy[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 1997, 36(13-14): 1 374-1 389.

      [7] Haubner R. αvβ3-Integrin Imaging: A New Approach to Characterise Angiogenesis?[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006, 33(S1): 54-63.

      [8] 李前偉.腫瘤整合素αvβ3受體顯像的研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學(xué):放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊(cè),2003,27(5):198-200.

      [9] Poethko T, Thumshirn G, Hersel U, et al. Improved Tumor Uptake, Tumor Retention and Tumor/Background Ratios of Pegylated RGD Multimers[J]. J Nucl Med, 2003, 44(Suppl): 46.

      [10] Thumshirn G, Hersel U, Goodman S L, et al. Multimeric Cyclic RGD Peptides as Potential Tools for Tumor Targeting: Solid-Phase Peptide Synthesis and Chemoselective Oxime Ligation[J]. Chem Eur J, 2003, 9(12): 2 717-2 725.

      [11] 圣 鋒,賀巍巍,劉昭飛,等.177Lu-DOTA/DTPA-Bz-Cys-RGD dimer的制備及正常鼠體內(nèi)生物分布[J].核化學(xué)與放射化學(xué),2008,30(2):71-74.

      [12] 張 燕,賀巍巍,賈 兵,等.90Y/177Lu標(biāo)記DOTA-Bz-RGD tetramer和DOTA-RGD tetramer的比較[J].核化學(xué)與放射化學(xué),2008,30(2):93-97.

      [13] 史繼云,余子璘,賈 兵,等.177Lu-DOTA-Bz-RGD dimer和177Lu-DOTA-Bz-PEG4-RGD dimer的制備及生物評(píng)價(jià)[J].同位素,2007,20(4):214-217.

      [14] 劉昭飛,賈 兵,史繼云,等.99Tcm-RGD環(huán)肽二聚體的制備及其體內(nèi)外評(píng)價(jià)[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志,2007,27(4):205-209.

      [15] Jia B, Shi J, Yang Z, et al.99mTc-Labeled Cyclic RGDfK Dimer: Initial Evaluation for SPECT Imaging of Glioma Integrin Alphavbeta3 Expression[J]. Bioconjug Chem, 2006, 17(4): 1 069-1 076.

      [16] Jia B, Liu Z, Shi J, et al. Linker Effects on Biological Properties of111In-Labeled DTPA Conjugates of a Cyclic RGDfK Dimer[J]. Bioconjug Chem, 2008, 19(1): 201-210.

      [17] Chen X, Tohme M, Park R. Micro-PET Imaging of Alphavbeta3-Integrin Expression With18F-Labeled Dimeric RGD Peptide[J]. Mol Imaging, 2004, 3(2): 96-104.

      [18] Wang L, Shi J, Kim Y S, et al. Improving Tumor-Targeting Capability and Pharmacokinetics of99mTc-Labeled Cyclic RGD Dimers With PEG(4) Linkers[J]. Mol Pharm, 2009, 6(1): 231-245.

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