不同潮氣量機械通氣對大鼠肺組織HMGB1表達的影響

任艷軍，張新日

（1.山西醫(yī)科大學，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院呼吸內(nèi)科，太原 030001）

機械通氣具有兩面性，使用不當會產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥——呼吸機相關性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）。據(jù)最新統(tǒng)計，VILI的發(fā)生率在機械通氣患者中高達15％，其發(fā)生機制非常復雜，涉及面非常廣泛［1］。本實驗試圖通過測定不同潮氣量機械通氣大鼠肺組織HMGB1mRNA及其蛋白的表達水平，探討HMGB1與VILI之間的關系，從而為VILI的基礎研究和臨床防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物分組及模型制備

雄性健康W istar大鼠24只（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：山醫(yī)字第070101），體重310～380 g，隨機分為3組：①對照組：未行機械通氣；②小潮氣量組：VT=7 m L/kg；③大潮氣量組： VT=30 m L/kg。

25％烏拉坦（4 m L/kg）腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開。除對照組外，其余各組大鼠均通過膠管與動物人工呼吸機（DH-150型，浙江大學醫(yī)學儀器廠制造）相連接，行機械通氣。各組大鼠的通氣參數(shù)除潮氣量外，其余均相同，即 I∶E=1∶3，F(xiàn)iO2= 21％，F(xiàn)=60次/min，通氣時間為150 min。

通氣結束后切斷腹主動脈放血處死大鼠，切取肺臟，左肺用中性甲醛液灌注固定，常規(guī)石蠟包埋用于普通病理、免疫組化和原位分子雜交檢測。右肺行支氣管肺泡灌洗術（2 m L×4次），留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）。BALF回收量不少于80％，以3 000 r/min離心 10 min，取上清液 -30℃凍存待測。

1.2 大鼠肺組織HE染色

采用伊紅-蘇木素染色法在光鏡下觀察肺組織和各級支氣管的損傷情況。

1.3 大鼠 BALF中髓過氧化物酶（M PO）活性測定

采用髓過氧化物酶檢測試劑盒測定 BALF中MPO活性。測定方法及操作步驟按試劑盒說明進行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 肺組織HMGB1免疫組織化學染色

采用鏈霉素親和-生物素-過氧化酶復合物（SABC）法對肺組織細支氣管上皮細胞進行HMGB1免疫組織化學染色，具體操作步驟參照試劑盒說明（試劑盒購自北京博奧森生物有限公司）。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶50，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。結果判斷：陽性染色為細胞胞漿和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在400倍光鏡下對每張組織切片隨機選取5個高倍視野或直徑100～200μm的細支氣管進行觀察。采用 BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分別檢測每個視野HMGB1陽性細胞的平均光密度值（A），以上述5個視野的平均值作為該大鼠細支氣管上皮細胞HMGB1蛋白表達的相對含量。

1.5 肺組織HMGB1m RNA原位雜交檢測

采用原位分子雜交技術檢測肺組織 HMGB1 mRNA表達，具體操作步驟按試劑盒（購自武漢博士德生物有限公司）說明進行。陽性染色為細胞胞漿呈棕黃色，檢測結果分析判斷方法同上。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 肺組織HE染色

HE染色光鏡下觀察，對照組肺泡結構和各級支氣管上皮完整，肺間質無炎癥細胞浸潤。小潮氣量僅見少量炎癥細胞浸潤，但肺間質無明顯水腫。大潮氣量組可見彌漫性肺間質水腫和炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂融合，小血管斷裂，肺泡腔內(nèi)有出血（圖1～2）。

2.2 大鼠BALF中M PO活性測定結果

各組大鼠BALF中MPO活性測定結果見表1。結果顯示：與對照組和小潮氣量組比較，大潮氣量組大鼠BALF中MPO活性明顯增高（均P＜0.01），對照組與小潮氣量組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

MPO活性用酶活力單位表示，即每克組織蛋白在37℃的反應體系中使H2O2分解為1μm為一個活力單位。

2.3 肺組織支氣管上皮細胞HMGB1免疫組織化學染色結果

各組大鼠肺組織支氣管上皮細胞HMGB1免疫組織化學染色結果見表1和圖3～5。結果顯示，與對照組和小潮氣量組比較，大潮氣量組肺組織支氣管上皮細胞HMGB1表達明顯增多（均P＜0.01），對照組與小潮氣量組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA，蛋白的表達及BALF中MPO活性（±s）Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

表1 各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA，蛋白的表達及BALF中MPO活性（±s）Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

注：與對照組比較：*P＜0.01；與小潮氣量組比較：#P＜0.01Note：*P ＜0.01，compared with the controe group；#P ＜0.01，compared with the low tidal volume group.

組別Group 例數(shù)n HMGB1 mRNA表達 HMGB1蛋白表達 BALF中MPO活性（U/L）對照組8 6.94±0.44 6.40±0.47 22.20±5.31小潮氣量組 8 7.27±0.43 6.94±0.57 23.21±6.32大潮氣量組 8 15.70±1.50*# 12.9±0.80*# 51.20±6.01*#

2.4 肺組織支氣管上皮細胞HMGB1 m RNA原位雜交檢測

各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA原位分子雜交測定結果見表1和圖6～8（圖1～8見彩插3）。結果顯示，大潮氣量組大鼠肺組織支氣管上皮細胞HMGB1 mRNA表達明顯高于對照組和小潮氣量組（均P＜0.01），對照組與小潮氣量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

大量研究表明，炎癥細胞和細胞因子在VILI發(fā)病過程中具有重要作用。肺泡上皮受到機械牽拉后可釋放多種炎癥細胞因子，如MIP-1α、TNF-α、LI-1β、LI-6及LI-8等，使中性粒細胞和巨噬細胞在肺內(nèi)大量募集活化。中性粒細胞和和巨噬細胞活化后不但產(chǎn)生大量彈力酶和膠原酶，還可釋放大量過氧化物。這些物質可直接或間接破壞肺泡上皮和血管內(nèi)皮細胞，引起肺組織損傷［2］。本研究也證實了這點，病理可見大潮氣量通氣組大鼠肺組織彌漫性肺間質水腫和炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚。Brad ley等［3］研究表明，MPO水平與中性粒細胞數(shù)之間存在極顯著的相關性，可作為中性粒細胞的活性標志。本研究顯示，大潮氣量組BALF中MPO活性明顯高于小潮氣量和正常組，表明中性粒細胞在肺內(nèi)募集，活化在VLIL中起著重要作用，同時也說明VLIL中確實存在炎癥反應。

高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種重要的炎癥因子，因其在聚丙酰胺凝膠電泳中具有高遷移率而得名。HMGB1的生物學活性極為豐富，不但參與細胞的分化、遷移和再生，還可介導機體的炎癥反應［4-5］。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)給予受試小鼠注射純化的重組 HMGB1（10～50μg/只），2 h內(nèi)即出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥癥狀 ，包括嗜睡、腹瀉等。大劑量（500 μg/只）給予，則5只受試鼠中3只分別在 18、30、36 h死亡 ，用帶有缺陷 HMGB1 cDNA轉化的大腸桿菌中提純出來的蛋白質片段給予對照組小鼠，則未出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，證明觀察到的毒性反應是HMGB1所特有的。Abraham等［7］發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管給小鼠注入HMGB1后發(fā)現(xiàn)，肺組織局部中性粒細胞聚集、間質水腫，同時炎癥細胞因子如 IL-1β、TNF-α、M IP-2等表達明顯增多，且呈劑量依賴效應。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可通過內(nèi)分泌和旁分泌形式作用于單核細胞、內(nèi)皮細胞等，使其表達一系列炎性介質和炎癥因子。這些炎性介質和炎癥因子又可進一步促進HMGB1的釋放，從而形成惡性循環(huán)，導致炎癥反應逐級放大［6］。

本研究結果顯示，大潮氣量組肺組織 HMGB1 mRNA及其蛋白表達水平較對照組和小潮氣量組明顯增高（均P＜0.01），說明HMGB1在VILI的發(fā)病中可能具有重要作用，但其具體作用機制目前尚不完全清楚。有文獻報道，RAGE（receptor for advanced glycation end products）是目前已知的HMGB1的高親和力受體，它是一種跨膜蛋白，能結合多種配體。HMGB1與RAGE在細胞表面結合，激發(fā)細胞內(nèi) p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases）、細胞外信號調節(jié)激酶1和2（ERK1/2）、NF-κB等多種信號轉導機制，從而使細胞釋放其他因子［8］。已有研究證實大潮氣量機械通氣可使局部肺組織炎癥細胞聚集、活化，并釋放多種炎癥介質和細胞因子，推測大潮氣量機械通氣可能直接啟動了 HMGB1mRNA轉錄，產(chǎn)生HMGB1由于其自身的毒性導致肺損傷，同時產(chǎn)生的HMGB1參與了其他炎癥介質和細胞因子的活化，這些炎癥介質和細胞因子進一步導致HMGB1mRNA及其蛋白的高表達，從而生成大量內(nèi)源性 HMGB1導致肺組織的進一步損傷。盡管研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在膿毒癥中是一種重要的晚期炎癥因子，但HMGB1可能早期就參與了VILI的發(fā)生。對照組和小潮氣量組上述各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），說明小潮氣量機械通氣對正常肺組織無明顯影響。

綜上所述，大潮氣量機械通氣可使肺組織HMGB1 mRNA及其蛋白表達水平明顯增高，從而產(chǎn)生大量的HMGB1參與了VILI的發(fā)生，但其具體作用機制還有待進一步研究。

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