黃加忠 李 靖

瘧疾是一種古老的傳染病，也是熱帶和亞熱帶地區(qū)危害最嚴(yán)重的傳染性疾病之一[1]。通過(guò)攜帶有瘧原蟲(chóng)的按蚊叮咬感染人，瘧原蟲(chóng)子孢子進(jìn)入人體，在肝臟內(nèi)發(fā)育增殖后釋放入血，一部分被吞噬細(xì)胞吞噬，一部分侵入紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂體增殖。主要引起發(fā)熱、貧血、脾腫大及腎臟損害；在惡性瘧疾高流行地區(qū)，5歲以下兒童、孕婦、HIV患者以及無(wú)瘧疾免疫力人群易引發(fā)兇險(xiǎn)型瘧疾，若未及時(shí)治療或處理不當(dāng)，易造成部分患者死亡。目前瘧疾仍流行于100多個(gè)國(guó)家、近一半的世界人口仍然面臨感染瘧疾的危險(xiǎn)，每年至少有3億人感染瘧疾，近300萬(wàn)人死亡[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，曾經(jīng)感染過(guò)瘧疾的個(gè)體中存在低效率和短暫性的保護(hù)性免疫，提示主動(dòng)免疫可能為瘧疾的防治提供幫助[3]。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，研究人員通過(guò)建立瘧疾感染動(dòng)物模型和志愿者參與的研究發(fā)現(xiàn)，研制使用相關(guān)疫苗以預(yù)防瘧疾的發(fā)生是可行的，部分疫苗也進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段?，F(xiàn)將瘧疾候選疫苗研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 紅細(xì)胞前期疫苗

瘧疾的紅細(xì)胞前期包括瘧原蟲(chóng)子孢子入侵宿主并進(jìn)入宿主的肝細(xì)胞，在肝細(xì)胞中進(jìn)行裂體增殖而成為肝期的裂殖體。針對(duì)此階段的疫苗主要作用就是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平的抗子孢子抗體，阻止子孢子進(jìn)入機(jī)體：子孢子侵染肝細(xì)胞后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞因子殺死感染的肝細(xì)胞內(nèi)子孢子，從而達(dá)到阻止子孢子侵入并且清除的目的。

1.1 射線照射減毒處理的子孢子[4]

使用經(jīng)射線照射減毒處理的子孢子對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和志愿者進(jìn)行接種免疫，證明有免疫保護(hù)效果。照射減毒處理的子孢子可以正常侵染肝細(xì)胞，但不能像未經(jīng)處理的子孢子一樣進(jìn)行核分裂發(fā)育成熟并繼續(xù)感染紅細(xì)胞，減毒子孢子可以存在于肝細(xì)胞內(nèi)數(shù)周至數(shù)月，此時(shí)感染的肝細(xì)胞可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和抗體介導(dǎo)的保護(hù)性免疫，這些免疫效應(yīng)物質(zhì)的靶點(diǎn)就是感染的肝細(xì)胞。盡管全蟲(chóng)體減毒疫苗表現(xiàn)出良好的免疫原性，但是它的安全性、合適的照射劑量、疫苗的規(guī)模生產(chǎn)以及儲(chǔ)存等問(wèn)題極難解決，接種所帶來(lái)的保護(hù)周期最長(zhǎng)為1年[5]，這些問(wèn)題使得射線照射減毒子孢子疫苗難以推廣。

1.2 遺傳性改變的瘧原蟲(chóng)

Mueller等[6]采用打靶剔除瘧原蟲(chóng)的UIS基因的方法，獲得減毒的紅前期瘧原蟲(chóng)。研究中以伯氏瘧原蟲(chóng)基因組DNA為PCR模板，擴(kuò)增UIS3基因的5'和3'非編碼區(qū)域，最終在NMRI小鼠中克隆被剔除了UIS3基因的伯氏瘧原蟲(chóng)，定名為UIS3（-）。在肝細(xì)胞中，子孢子向滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)型的初期不需要UIS3基因，但滋養(yǎng)體的進(jìn)一步發(fā)育以及發(fā)育到紅前期裂殖體需要UIS3基因，只有很少一部分的UIS3（-）子孢子能轉(zhuǎn)型至球形的紅前期滋養(yǎng)體，但個(gè)體小且不能發(fā)育為成熟的紅前期裂殖體。用高達(dá)10萬(wàn)個(gè)UIS3（-）子孢子感染SD大鼠后，未檢出紅內(nèi)期的瘧原蟲(chóng)。UIS3（-）子孢子以不同接種劑量、不同接種方式（靜脈或皮下）、不同免疫流程免疫C57BL/6小鼠，然后用野生型子孢子靜脈攻擊或感染性蚊蟲(chóng)叮咬，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的外周血原蟲(chóng)血癥。所有組別的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示UIS3（-）子孢子具有消除性免疫保護(hù)作用，并有很好的持久性。有的學(xué)者也采用了同樣的方法打靶踢除UIS4、P36p基因，獲得減毒子孢子，作為疫苗，也取得成功[6-8]。

1.3 紅細(xì)胞前期亞單位疫苗

1.3.1 環(huán)子孢子蛋白疫苗

Enea等[9]采用DNA重組技術(shù)克隆出環(huán)子孢子蛋白（CSP），并被確認(rèn)為是有保護(hù)性的靶抗原，此項(xiàng)成果大大激發(fā)了研究人員的熱情，在此后的若干年中至少有20種以上的重組抗原被確認(rèn)同樣具有免疫原性[10]，這些都被作為候選疫苗進(jìn)行研究并取得進(jìn)展。CSP蛋白是針對(duì)該期原蟲(chóng)的重要靶抗原，相應(yīng)的抗體可阻止子孢子的進(jìn)入。CSP分子中央?yún)^(qū)域存在重復(fù)區(qū)，兩側(cè)區(qū)域是區(qū)域Ⅰ和區(qū)域Ⅱ，含有與肝細(xì)胞結(jié)合的功能域[11]。以CSP為基礎(chǔ)的RTS、S候選疫苗己取得了成功。RTS、S惡性瘧3D7株編碼環(huán)子孢子蛋白207～395氨基酸序列與乙型肝炎表面抗原氨基端基因融合而成，表達(dá)單一鏈的蛋白，CSP包含19個(gè)NANP重復(fù)序列及其C末端。與佐劑AS02A混合，可誘導(dǎo)出高水平的針對(duì)環(huán)子孢子中央重疊區(qū)的抗體，并能誘導(dǎo)出Thl型細(xì)胞反應(yīng)。美國(guó)GSK生物公司（GSKBio）和美國(guó)陸軍醫(yī)學(xué)研究院（WRAIR）合作開(kāi)展了該疫苗的臨床前和臨床試驗(yàn)。Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該疫苗在人體中是安全的，并能產(chǎn)生強(qiáng)免疫反應(yīng)。然而，這種保護(hù)性免疫持續(xù)時(shí)間很短，當(dāng)6個(gè)月后再次感染時(shí)，絕大多數(shù)自愿者已失去原有的保護(hù)力[12]。西班牙巴塞羅那大學(xué)的熱帶病專家Pedro Alonso等對(duì)94個(gè)莫桑比克鄉(xiāng)下嬰兒在10、14及18周時(shí)分別注射了RTS、S，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射了RTS、S的嬰兒患瘧疾的概率比對(duì)照組嬰兒要低65%，且不良反應(yīng)并不比普通接種疫苗多[13]?？蒲腥藛T采用人工合成長(zhǎng)肽方法產(chǎn)生了102個(gè)CSP C末端的合成肽，經(jīng)與鋁佐劑和ISA720佐劑乳化后進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該疫苗具有高免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生識(shí)別子孢子的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

1.3.2 ME-TRAP疫苗

該疫苗由一個(gè)多表位片段（ME）和血凝素相關(guān)黏附蛋白（TRAP）融合而成，含6種來(lái)自紅前期抗原和兩個(gè)B細(xì)胞表位。TRAP是一種跨膜蛋白，與子孢子的運(yùn)動(dòng)性及感染性有關(guān)。先用DNA質(zhì)粒進(jìn)行初次免疫，然后用病毒載體抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，能有效的誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫。Ⅰ和Ⅱa期臨床試驗(yàn)顯示：部分自愿者延遲出現(xiàn)原蟲(chóng)血癥，并有部分自愿者獲得保護(hù)[14]。

1.3.3 肝期抗原1 （LSA-l）

LSA-l是目前已知的惟一的肝侵染期特異性分泌蛋白，子孢子侵染肝細(xì)胞后，形成納蟲(chóng)空泡內(nèi)腔。流行病學(xué)調(diào)查顯示，接觸過(guò)瘧原蟲(chóng)的個(gè)體對(duì)LSA-l抗原有免疫反應(yīng)。重組表達(dá)的LSA-l候選疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的Ⅰ～Ⅱa階段，受試對(duì)象在接受瘧原蟲(chóng)暴露后，免疫強(qiáng)化組均得到免疫保護(hù)，未出現(xiàn)延遲原蟲(chóng)血癥[15]。

1.4 紅細(xì)胞前期的DNA疫苗

DNA疫苗屬于新一代疫苗，具有亞單位疫苗和全蟲(chóng)疫苗的優(yōu)點(diǎn)，生物性質(zhì)穩(wěn)定。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種DNA疫苗后，能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生較高水平的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Eric等[16]構(gòu)建了一種可表達(dá)6種候選抗原的DNA疫苗，研究表明，接種此疫苗后，能產(chǎn)生針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的T細(xì)胞免疫。

2 紅細(xì)胞內(nèi)期候選疫苗

在此階段，由肝細(xì)胞釋放出的裂殖子侵入紅細(xì)胞，進(jìn)行裂體增殖。由于大部分時(shí)間存在于紅細(xì)胞內(nèi)，只有較為短暫的時(shí)間游離于血液中與宿主免疫系統(tǒng)接觸誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體依賴和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此裂殖子表面蛋白和頂端復(fù)合體抗原成為研究的焦點(diǎn)，多種抗原被作為候選疫苗進(jìn)行研究。主要有AMA-1（頂端膜抗原1）、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4（裂殖子表面蛋白1/2/3/4）、GLURP-1（谷氨酸富含蛋白1）、RESA（環(huán)狀體感染紅細(xì)胞表面抗原）、SERA5（絲氨酸富含蛋白5）、EBA-175（紅細(xì)胞結(jié)合抗原）、EBP-2（紅細(xì)胞結(jié)合蛋白2）、RAP-2、EMP-1（惡性瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞膜蛋白）以及DBL-a（Duff結(jié)合樣區(qū)域a）。

2.1 MSP-1候選疫苗

MSP-1是一前體蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為195×103，可分裂成4個(gè)片段，從N端至C端，依次裂解為相對(duì)分子質(zhì)量為83×103、（28～30）×103、（36～41）×103和42×103片段。第二次裂解在裂殖子侵入紅細(xì)胞前，C末端的相對(duì)分子質(zhì)量為42×103段（MSP-l42）再被裂解成相對(duì)分子質(zhì)量為33×103和19×103兩個(gè)片段，僅C末端的相對(duì)分子質(zhì)量為19×103片段（MSP-l42）隨裂殖子進(jìn)入紅細(xì)胞。MSP-l42一般認(rèn)為與裂殖子進(jìn)入紅細(xì)胞的過(guò)程有關(guān)。用惡性瘧3D7株的MSP-142與AS02A佐劑結(jié)合，在非瘧疾流行區(qū)人群中進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，顯示其有很好的安全性和較強(qiáng)的免疫原性。在Ⅱa攻擊試驗(yàn)中，MSP-l42單獨(dú)使用或與RTS、S/AS02A聯(lián)合使用都未能顯示出其具有抗感染的保護(hù)作用。肯尼亞瘧疾流行區(qū)成人中Ⅰ期安全性試驗(yàn)已順利完成，計(jì)劃在西肯尼亞瘧疾流行區(qū)對(duì)l～4歲兒童中進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

2.2 AMA-l候選疫苗

美國(guó)過(guò)敏與傳染病研究所將從惡性瘧原蟲(chóng)3D7株和FVO株表達(dá)的重組蛋白等量混合，命名為AMAl-Cl，Ⅰa期臨床試驗(yàn)采用的的是AMAl-C1/鋁膠佐劑，目前正在馬里采用AMA1-Cl/鋁膠佐劑+CPG7909針對(duì)成人進(jìn)行Ⅰb期試驗(yàn)，針對(duì)兒童的Ⅰ/Ⅱb期安全性及有效性試驗(yàn)正在進(jìn)行。

2.3 GLURP候選疫苗

該疫苗是惡性瘧原蟲(chóng)表達(dá)的蛋白，在紅前期及紅內(nèi)期均可見(jiàn)。GLURP85-213核酸片段常被選擇用于合成長(zhǎng)鏈肽，在其中包含P3抗原決定簇，可與抗體在體外試驗(yàn)中表達(dá)強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)，Ⅰ期臨床試驗(yàn)表現(xiàn)出較好的免疫原性和安全性[17]。

2.4 SERA候選疫苗

SERA候選疫苗分子量較大，可裂解成3個(gè)抗原片段，分別是相對(duì)分子質(zhì)量18×103、47×103和50×103，日本正在作基于SERA抗原的疫苗Ⅰ期試驗(yàn)。

上述候選疫苗目前全部進(jìn)入臨床試驗(yàn)并取得階段性成果，鑒于裂殖子侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中有多種蛋白參與，因此單一采用疫苗的保護(hù)性將很弱，甚至可能有免疫逃逸現(xiàn)象，故研究采用多種抗原混合制備疫苗，但是多種蛋白混合使用，是否會(huì)導(dǎo)致相互間的拮抗?因此采用基因重組表達(dá)的方式構(gòu)建融合蛋白可能是形成最終疫苗的良策。上海第二軍醫(yī)大的瘧疾疫苗課題組在國(guó)內(nèi)成功構(gòu)建了惡性瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期融合蛋白PfCP-2.9，該抗原與ISA720佐劑混合后免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取得很好的效果，目前也正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

3 有性生殖期候選疫苗（傳播阻斷性疫苗）

通過(guò)阻止瘧原蟲(chóng)在蚊蟲(chóng)體內(nèi)的有性增殖而達(dá)到阻斷瘧疾傳播的目的，在這個(gè)過(guò)程中，雖然不能使個(gè)體免于瘧疾感染，也不能減輕癥狀，但能阻斷蚊蟲(chóng)將瘧原蟲(chóng)從一個(gè)宿主傳播至另一個(gè)宿主，并可用于旅行者的免疫，以避免將瘧原蟲(chóng)從疫區(qū)帶回，造成本地區(qū)流行的后果。目前針對(duì)此過(guò)程候選疫苗研究較少。在諸多的文獻(xiàn)中僅見(jiàn)有Hisaeda報(bào)道了Pvc25可能是間日瘧原蟲(chóng)較理想的傳播阻斷疫苗候選抗原。

4 基于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的瘧疾疫苗

傳統(tǒng)的疫苗研究方法是通過(guò)生物化學(xué)、免疫學(xué)及微生物學(xué)的方法對(duì)病原體進(jìn)行分析，最終獲得有效的疫苗，基因組學(xué)的疫苗設(shè)計(jì)能夠從數(shù)據(jù)庫(kù)中直接選取相關(guān)序列，預(yù)測(cè)抗原，并且這個(gè)過(guò)程不需要依賴體外培養(yǎng)病原體。1996年惡性瘧原蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)誕生，為選擇更多有效的瘧疾疫苗提供有力的幫助。蛋白質(zhì)組學(xué)的方法則可采用特定位點(diǎn)重組克隆技術(shù)消除了核酸內(nèi)切酶和連接酶的使用限制，提供了適合高通量過(guò)程的一些優(yōu)勢(shì)。20世紀(jì)80年代成功克隆表達(dá)了惡性瘧CSP蛋白后，在很短的時(shí)間采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)了眾多的候選疫苗。反向疫苗技術(shù)就是利用了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的信息，高通量的篩選有效保護(hù)性成分。Mu等[18]采用了基因組學(xué)技術(shù)分析了未知靶抗原蛋白多態(tài)性，并最終成功獲得新的候選疫苗。

5 結(jié) 論

瘧原蟲(chóng)生活史復(fù)雜，在不同的時(shí)期表達(dá)不同的抗原，沒(méi)有主導(dǎo)抗原，導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)易逃逸宿主免疫攻擊。目前研究發(fā)現(xiàn)有近50種候選抗原，但是每一種抗原作為疫苗接種后，產(chǎn)生不了持久強(qiáng)大的免疫保護(hù)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)的結(jié)果不一，提示瘧原蟲(chóng)感染宿主后，由于宿主的種屬不同可能存在不同的免疫機(jī)制，所以需要加強(qiáng)瘧原蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究；在選擇疫苗時(shí)需要針對(duì)瘧原蟲(chóng)的不同生活期，選用多種復(fù)合抗原，需通過(guò)基因重組的方法制備融合抗原；同時(shí)需進(jìn)行免疫佐劑研究，包括一些可以增強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞因子。

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