周瑞敏，李素華，高麗君，錢 丹，楊成運(yùn)，劉 穎，趙玉玲，張紅衛(wèi)

河南省疾病預(yù)防控制中心；河南省傳染病病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450016

諾氏瘧原蟲(Plasmodiumknowlesi)在自然界中主要寄生于獼猴體內(nèi)，20世紀(jì)30年代早期，印度加爾各答熱帶醫(yī)學(xué)院首次發(fā)現(xiàn)并對(duì)其進(jìn)行了研究，其可通過血液傳染給人類[1-3]。1954年，Chin等[4]報(bào)道了第一例人類自然感染諾氏瘧原蟲病例，為美國(guó)陸軍的一名調(diào)查員在馬來西亞森林中工作時(shí)感染。人類自然感染諾氏瘧原蟲一直被認(rèn)為非常少見，直到2004年Singh等[5]應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)馬來西亞婆羅洲鏡檢陽(yáng)性的瘧疾病例進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)許多患者為諾氏瘧原蟲感染，證實(shí)了人類自然感染諾氏瘧原蟲的普遍存在。此后，幾乎東南亞所有國(guó)家都有人類自然感染諾氏瘧原蟲的報(bào)道，諾氏瘧原蟲亦被認(rèn)為是感染人類的第五種瘧原蟲[6-8]。

我國(guó)曾有多位學(xué)者報(bào)道過非典型形態(tài)的間日瘧原蟲感染，如間日瘧原蟲多核亞種，但缺乏分子生物學(xué)證據(jù)[9]。2006年，朱淮民等[10-11]對(duì)云南省墨江縣1998年緬甸輸入的“間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲混合感染”患者血涂片進(jìn)行回顧性復(fù)查，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特異，經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)確診為諾氏瘧原蟲感染。2014年10月，潘波等[12]報(bào)道了廣東省首例輸入性諾氏瘧原蟲感染病例，患者從馬來西亞旅游回國(guó)。2017年10月，河南省確診省內(nèi)首例輸入性諾氏瘧原蟲感染病例，也為我國(guó)第三例輸入性諾氏瘧原蟲感染病例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1樣本來源由河南省瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室收集瘧疾患者的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室復(fù)核，主要包括有厚、薄血膜的血涂片和治療前采集的EDTA抗凝血，血涂片室溫保存，血液樣本-80 ℃保存。樣本的采集和流行病學(xué)調(diào)查均獲得了患者的知情同意。

1.2瘧原蟲檢測(cè)血涂片的制作和瘧原蟲檢測(cè)方法參照《瘧疾的診斷》標(biāo)準(zhǔn)(WS 259-2015)。檢測(cè)厚血膜確定為瘧原蟲陽(yáng)性后，通過薄血膜上蟲體形態(tài)確定蟲種。

1.3瘧原蟲抗原檢測(cè)采用快速診斷實(shí)驗(yàn)(rapid diagnostic test, RDT)進(jìn)行抗原檢測(cè)。萬孚瘧原蟲快速檢測(cè)試劑盒和CareStartTM瘧原蟲快速檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司和美國(guó)Access Bio公司。按照試劑盒使用說明書對(duì)EDTA抗凝血樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.4瘧原蟲18SrRNA的檢測(cè)及序列分析采用巢式PCR法檢測(cè)。核酸提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，PCR 反應(yīng)預(yù)混液購(gòu)自美國(guó)Promega公司，核酸電泳DNA標(biāo)志物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，Gold view核酸染料購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，瓊脂糖為西班牙Biowest公司產(chǎn)品。從血液樣本中提取瘧原蟲基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照參考文獻(xiàn)[4]合成針對(duì)瘧原蟲18S rRNA的引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用屬特異性引物rPLU1和rPLU5進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×PCR 預(yù)混液 10 μL，上、下游引物(10 mol/μL)各0.6 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。將第一輪PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，采用ChromasPro軟件將序列進(jìn)行拼接，將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過BLAST進(jìn)行同源性比較。采用蟲種特異性引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，引物分別為間日瘧原蟲rV1V1和rV1V2、惡性瘧原蟲rFAL1和rFAL2、三日瘧原蟲rMAL1和rMAL2、卵形瘧原蟲rOVA1和rOVA2、諾氏瘧原蟲Pmk8和Pmkr9，以第一輪產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系同第一輪，反應(yīng)條件同第一輪但退火溫度改為58 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5診斷與治療按照我國(guó)現(xiàn)行《瘧疾的診斷》標(biāo)準(zhǔn)(WS 259-2015)進(jìn)行診斷。結(jié)合2015年世界衛(wèi)生組織推薦的《抗瘧藥物使用指南》(第三版)和我國(guó)《抗瘧藥物使用規(guī)范》(WS/T 485-2016)對(duì)患者進(jìn)行正規(guī)治療：給予磷酸氯喹和磷酸伯氨喹8 d療法，服藥后1周再口服雙氫青蒿素磷酸哌喹片。

2 結(jié)果

2.1患者基本情況周某，男，51歲，河南省信陽(yáng)市羅山縣人，于2017年3月到印度尼西亞從事木材加工工作，工作地點(diǎn)位于森林附近，自述經(jīng)常能見到猴子(具體品種不詳)出沒，但無近距離接觸。患者2017年9月11日回國(guó)，19日出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，每天夜間發(fā)作，體溫最高達(dá)39.8 ℃，伴有出汗和畏寒，無其他不適癥狀，在本村診所按照感冒治療數(shù)日后未見好轉(zhuǎn)，經(jīng)另外一名鄉(xiāng)村醫(yī)生建議到該縣疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行瘧原蟲檢查。采集末梢靜脈血制作血涂片，吉姆薩染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)瘧原蟲，診斷為三日瘧原蟲感染?；颊哐簶颖舅椭梁幽鲜〖膊☆A(yù)防控制中心瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鏡檢、RDT和PCR復(fù)核，確診為諾氏瘧原蟲感染?；颊咴?014年7月至2016年1月在埃塞俄比亞務(wù)工，但否認(rèn)期間有瘧疾史；在印度尼西亞務(wù)工期間亦未患瘧疾；近期無輸血史。

2.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.2.1 鏡檢結(jié)果 見圖1。薄血膜中，被諾氏瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞不脹大，早期滋養(yǎng)體的形態(tài)特征與惡性瘧原蟲相似，蟲體較小，具有雙核和一個(gè)紅細(xì)胞多個(gè)瘧原蟲寄生；其他階段的形態(tài)特征則和三日瘧原蟲相似，瘧色素出現(xiàn)較早，呈黑褐色，顆粒粗大，與細(xì)胞質(zhì)交織在一起；晚期滋養(yǎng)體有成帶狀發(fā)展趨勢(shì)或形成阿米巴樣。厚血膜中，早期滋養(yǎng)體形態(tài)與惡性瘧原蟲相似，而其他階段形態(tài)與三日瘧原蟲相似。故通過鏡檢很難準(zhǔn)確識(shí)別諾氏瘧原蟲的形態(tài)。

A～C：薄血膜；D～E：厚血膜圖1 血涂片中諾氏瘧原蟲形態(tài)(×1 000)

2.2.2 RDT 瘧原蟲抗原檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2.3 瘧原蟲18S rRNA的檢測(cè) 第一輪PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 600 bp，同源性比對(duì)結(jié)果顯示與GenBank中諾氏瘧原蟲18S rRNA部分基因序列(GenBank登錄號(hào)為DQ350266.1、L07560.1和AY327554.1)的一致性達(dá)99%。所得序列已提交GenBank(登錄號(hào)為MG570077)。采用諾氏瘧原蟲蟲種特異性引物Pmk8和Pmkr9進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，在152 bp位置處有一特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小一致；而采用其他4種瘧原蟲蟲種特異性引物未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。

1、4、7、10、13：患者樣本；2、5、8、11：分別為間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲陽(yáng)性對(duì)照；3、6、9、12、14：陰性對(duì)照；M：DNA標(biāo)志物

圖2巢式PCR

2.3診斷與治療結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)史和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，確診為境外輸入性諾氏瘧原蟲感染病例。治療后經(jīng)血涂片鏡檢未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲。1個(gè)月后電話回訪，未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討論

1932年，諾氏瘧原蟲被發(fā)現(xiàn)并命名后，Knowlesi和Gupta[1]對(duì)其進(jìn)行了更深入的研究，通過人體實(shí)驗(yàn)觀察到3名感染諾氏瘧原蟲的患者呈現(xiàn)每天發(fā)熱的周期性。本研究中該患者每天夜間發(fā)熱，伴有出汗和畏寒，有諾氏瘧原蟲感染的典型臨床表現(xiàn)，同時(shí)該患者在森林附近工作，具有流行病學(xué)史，懷疑為自然感染的諾氏瘧原蟲病例，需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診。

鏡檢作為瘧原蟲檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用，但也常常因血涂片制作染色差、原蟲密度低、蟲體變形或形態(tài)的相似性等原因發(fā)生誤診或漏診。該患者最初被診斷為三日瘧，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，早期滋養(yǎng)體的形特征與惡性瘧原蟲相似，其他階段的形態(tài)特征則和三日瘧原蟲相似。1932年，Knowlesi和Gupta[1]首次提出了諾氏瘧原蟲和三日瘧原蟲在形態(tài)上有相似性。Cox-Singh等[13]讓12家醫(yī)院的鏡檢專家對(duì)349份確診的諾氏瘧原蟲感染樣本進(jìn)行鏡檢，91%的樣本被診斷為三日瘧原蟲，剩余樣本則被診斷為間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲。故通過形態(tài)學(xué)檢測(cè)很難確診諾氏瘧原蟲感染。萬孚和CareStartTM瘧原蟲快速檢測(cè)試劑盒含有瘧原蟲乳酸脫氫酶(plasmodium lactate dehydrogenase, panLDH)抗體，為“泛瘧疾抗體”，主要用于檢測(cè)感染人類的4種常見瘧原蟲的抗原。諾氏瘧原蟲導(dǎo)致人類感染瘧疾的重要性未引起足夠的重視，目前所有商品化的瘧原蟲快速檢測(cè)試劑盒均不能用于諾氏瘧原蟲的檢測(cè)[14]，本研究中兩種試劑盒的RDT結(jié)果均為陰性。

與鏡檢相比，分子生物學(xué)方法對(duì)瘧原蟲檢測(cè)的敏感性和特異性更高[15-19]。本研究中，利用巢式PCR方法，通過諾氏瘧原蟲蟲種特異性引物Pmk8和Pmkr9，從患者血樣擴(kuò)增出了預(yù)期的目的條帶，序列分析進(jìn)一步證實(shí)為諾氏瘧原蟲感染。

本研究充分分析了患者的流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，最終確診為輸入性諾氏瘧原蟲感染。目前，我國(guó)暫無針對(duì)諾氏瘧原蟲感染的抗瘧藥物使用規(guī)范，參考2015年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《抗瘧藥物使用指南》(第三版)，結(jié)合我國(guó)《抗瘧藥物使用規(guī)范》(WS/T 485-2016)的用藥標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)患者進(jìn)行磷酸氯喹和磷酸伯氨喹8 d療法，服藥后1周再口服雙氫青蒿素磷酸哌喹片，患者痊愈。我國(guó)廣東輸入性諾氏瘧原蟲感染病例同樣采用了該方案治療[12]。此外，東南亞等國(guó)家和地區(qū)采用類似的治療方法也治愈了許多諾氏瘧原蟲感染患者[20]。本研究再次證實(shí)以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方法對(duì)治療諾氏瘧原蟲感染是安全、有效、可行的。

人類自然感染諾氏瘧原蟲輸入病例對(duì)我國(guó)瘧疾防治工作提出了新的挑戰(zhàn)，需要及時(shí)更新針對(duì)諾氏瘧原蟲感染的診斷、治療和防控等相關(guān)知識(shí)，同時(shí)提高臨床醫(yī)生和瘧疾防治專業(yè)人員對(duì)諾氏瘧原蟲感染的認(rèn)識(shí)和診治水平，為我國(guó)2020年實(shí)現(xiàn)消除瘧疾的目標(biāo)提供保障。