隋鳳湖

白色念珠菌（C．a(chǎn)lbicans）是一種可寄生在人體的口腔、胃腸道、女性生殖道黏膜及體表潮濕部位的正常菌群之一，同時又是重要的機會性致病菌。一旦機體的免疫力下降或者正常的菌群平衡被破壞，它就會在黏膜下大量繁殖，侵入深層組織，可引起反復(fù)淺表性黏膜感染或嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染。據(jù)英國醫(yī)學(xué)真菌學(xué)會（BSMM）和英國抗微生物化療協(xié)會（BSAC）所屬的95家微生物實驗室的統(tǒng)計資料，在英國每年根據(jù)實驗室提供的資料協(xié)助診斷的念珠菌血癥就達500～600萬例，遠遠高于其他真菌感染。在念珠菌感染中，白色念珠菌占60%以上。這些情況的出現(xiàn)與免疫抑制劑、廣譜抗生素的大量應(yīng)用，導(dǎo)管、插管的普遍開展，癌癥患者的放療和化療，器官移植的廣泛實施，免疫抑制患者尤其是HIV感染患者的不斷增多等因素密切相關(guān)。美國疾病預(yù)防控制中心于1992至1993年進行的一項流行病學(xué)調(diào)查顯示：念珠菌菌血癥的年發(fā)病率為8/10萬～10/10萬，病死率29%～40%。白色念珠菌已成為影響人們生活質(zhì)量，威脅生命健康的重 要條件致病性真菌之一。目前由于抗真菌藥物的應(yīng)用又使得耐藥菌株不斷增多。因此，選擇良好的疫苗激發(fā)機體的適應(yīng)性和固有性免疫將成為白色念珠菌感染的重要策略。筆者就目前有關(guān)白色念珠菌疫苗研究進展作一簡要綜述。

1 全菌疫苗

白色念珠菌的感染是多途徑的，又有多態(tài)性，同時又有很多血清型的存在。白色念珠菌的全菌疫苗一般達不到預(yù)期的接種效果。但對局部黏膜免疫有一定的作用。Fukuizumi等[1]為驗證感染性全菌疫苗的可能性，將經(jīng)滅活的白色念珠菌在家兔扁桃體上接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生了抑制白色念珠菌與上皮細胞黏附的抗體，證明用常見血清型的全菌滅活疫苗可以預(yù)防口腔念珠菌病。

2 疫苗候選抗原

白色念珠菌是雙相菌，具有多種致病因子。包括黏附蛋白、侵襲性蛋白酶和表面受體等。其中大多數(shù)是抗原物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。作為疫苗候選抗原應(yīng)具有：①良好的免疫原性；②可刺激機體產(chǎn)生保護性的細胞免疫和體液免疫。目前研究較多的有以下幾種抗原：熱休克蛋白90（Hsp90）、凝集樣蛋白（Alsp）、甘露糖蛋白65（MP65），由于它們具有較好的免疫原性，能夠使動物體獲得抗白色念珠菌的免疫保護作用，因而可作為該菌疫苗的候選抗原。

2.1 Hsp90

Hsp90是存在于念珠菌細胞壁與胞質(zhì)的一種蛋白質(zhì)。Fukuizumi等從系統(tǒng)性念珠菌感染的患者血清中分離Hsp90（相對分子質(zhì)量90000）和它的降解片段（相對分子質(zhì)量47000）。經(jīng)檢測，92%系統(tǒng)性白色念珠菌感染患者和恢復(fù)患者均產(chǎn)生了高滴度的針對47000（相對分子質(zhì)量）分子的抗體；然而，病情惡化患者的血清中47000（相對分子質(zhì)量）分子抗原滴度升高，不含有或者僅含有微量的抗47000（相對分子質(zhì)量）分子抗體。推測抗Hsp90的抗體具有保護作用。Hsp90或其特異性抗體，不僅為診斷系統(tǒng)性念珠菌感染提供了一種非常有用的血清學(xué)標(biāo)志物，而且Hsp90有可能成為防治白色念珠菌感染的疫苗候選抗原。

2.2 Alsp

Als1p是白色念珠菌凝集樣基因1編碼的一種蛋白，其作用是負責(zé)白色念珠菌與人細胞的結(jié)合。Als1蛋白結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白超家族同源，其蛋白特異性由其N末端決定。白色念珠菌Als蛋白家族至少有9個基因編碼的蛋白組成，其中Als1和Als3都是編碼黏附素的基因，Als1蛋白主要黏附內(nèi)皮細胞，而Als3蛋白黏附上皮細胞。因為此蛋白表達在宿主細胞表面，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠抵抗白色念珠菌與內(nèi)皮細胞的黏附，所以Alslp或Als3p的重組N末端區(qū)域（rAlsp-N或rAls3p-N）是很好的疫苗候選蛋白。

2.3 MP65

白色念珠菌細胞壁中激發(fā)機體免疫能力的成分主要是蛋白和糖蛋白，而糖蛋白中最主要的就是甘露糖蛋白。MP65是從白色念珠菌細胞壁中純化出來的65000的甘露糖蛋白，具有很好的免疫原性，介導(dǎo)抗白色念珠菌的免疫反應(yīng)。體外研究證明MP65能誘導(dǎo)人類T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而DC細胞和Th細胞的激活密切相關(guān)。DC細胞是通過甘露糖、巖藻糖受體、TLR2和TLR4識別念珠菌細胞，MP65激活DC并且誘導(dǎo)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生及IL-12基因的表達。MP65通過刺激協(xié)同刺激分子的表達增加和CD14、FcR的表達減少而誘導(dǎo)DC成熟，從而啟動抗原提呈，進一步在其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞分子作用下激活Th1．細胞。另外也證明MP65的核心蛋白和甘露糖部分都是誘導(dǎo)機體保護性免疫反應(yīng)的必要成分，它們的作用也是不重疊的。這一切提示，MP65也有望成為人類預(yù)防白色念珠菌感染的疫苗候選抗原。

3 蛋白疫苗

隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，利用新的生化技術(shù)、物理方法和基因工程技術(shù)可將上述念珠菌中疫苗候選抗原進行克隆、表達和純化，制備成重組蛋白疫苗。

Raska等將重組的Hsp90蛋白（rHsp90）從不同途徑（皮內(nèi)、鼻腔內(nèi)和靜脈內(nèi)）免疫BALB/c小鼠，rHsp90能夠明顯提高小鼠血清和陰道內(nèi)rHsp90特異性的IgG和IgA水平，并且在體外可升高rHsp90特異的脾細胞反應(yīng)。小鼠動物模型體內(nèi)研究顯示：MP65能誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和Thl型細胞因子的產(chǎn)生，并對致死性念珠菌感染有部分保護作用。

Ibrahim等構(gòu)建了rAlslp-N蛋白，并將其免疫BALB/c小鼠，證明，rAlslp-N。保護性劑量可以增加對Thl型細胞的刺激并誘導(dǎo)體內(nèi)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。用白色念珠菌的致死量攻擊后，可以提高小鼠的存活率。而抗體的滴度與保護性沒有相關(guān)性。說明此蛋白在抗白色念珠菌免疫中是刺激細胞介導(dǎo)的細胞免疫而不是體液免疫。另外，rAlslp-N也可以提高遠交系小鼠抗播散性白色念珠菌病的保護性，免疫后可以抵抗多種毒力的白色念珠菌和非念珠菌的感染。rAlslp-N的皮下免疫效果更好，對免疫缺陷小鼠的侵襲性感染也有很好的保護作用。Spellberg等比較了rAlsl p-N和rAls3p-N兩種蛋白對小鼠播散性念珠菌病、口咽部及陰道念珠菌病的預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)rAls3p-N抗播散性念珠菌病的作用與rAlsl p-N的效果相同，但是抗口腔和陰道黏膜的念珠菌病比rAlsl p-N效果更好。因此rAlsl p-N有望成為一個更好的同時預(yù)防播散性和黏膜念珠菌病的候選蛋白疫苗。

4 多肽疫苗

多肽疫苗是研究者根據(jù)有效免疫原的氨基酸序列，設(shè)計和合成的免疫原性多肽，試圖以最小的免疫原性肽來激發(fā)有效的特異性免疫應(yīng)答。Matthews和Burnie釗繪制出Hsp90的C末端的連續(xù)表位C、B和H表位。其中表位C，由LKVIRK6種氨基酸組成，用免疫印跡檢測，47000反應(yīng)的患者血清均識別表位C。Matthews和Burnie又以化學(xué)合成的LKVIRK表位與匙孔藍蛋白耦聯(lián)物作為免疫原，再用免疫動物獲得的抗Hsp90多克隆抗體和單克隆抗體對感染小鼠進行免疫治療，結(jié)果表明抗體治療能明顯降低系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠的病死率，并使小鼠腎臟感染的真菌數(shù)量顯著減少。Yang等利用展示有LKVIRK表位（C表位）的雜合噬菌體作為抗原，免疫C57BL/6J小鼠，然后在小鼠的系統(tǒng)性念珠菌感染模型中評價其免疫保護作用。結(jié)果證明該雜合噬菌體能夠誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠產(chǎn)生高滴度的抗Htsp90抗體，而且對系統(tǒng)性念珠菌感染的小鼠具有免疫保護作用。說明展示有白色念珠菌LKVIRK表位的雜合噬菌體有可能成為一種新形式的真菌疫苗。

5 糖結(jié)合疫苗

白色念珠菌的感染是多種途徑，無論是蛋白還是糖類分子，大多數(shù)處于研究階段，還未應(yīng)用于人體。另外，白色念珠菌和其他真菌作為疫苗的候選蛋白大多都含有糖類成分，而這些糖類成分都與免疫反應(yīng)的激活密切相關(guān)，其中大多數(shù)都是先通過結(jié)合固有性免疫細胞表面受體，激活固有性免疫細胞，再進一步誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的發(fā)生。如甘露糖和葡聚糖，都是多種真菌細胞壁的成分，它們都是通過識別不同的模式識別受體（PRR）而發(fā)揮免疫作用的。如β-葡聚糖，通過識別TLR2、Dectin-1和TLR4來激活巨噬細胞和單核細胞，啟動免疫反應(yīng)。因為β-葡聚糖存在廣泛，可以考慮用這種糖類免疫機體，使其獲得抗多種真菌感染的免疫保護作用。Torosantucci等用一種與病原性真菌無關(guān)的昆布多糖，它來源于棕色海藻，有β-葡聚糖的特性，可替代真菌成為免疫原。但是由于昆布多糖本身免疫原性較弱，他們將白喉毒素CRMl97（是一種用于人體的安全的蛋白疫苗）與之結(jié)合，制備成一種糖-蛋白結(jié)合性疫苗（Lam-CRM）。用這種疫苗免疫小鼠，小鼠血清中產(chǎn)生了抗β-葡聚糖的IgM和IgG型的抗體，經(jīng)2倍的LD50劑量的白色念珠菌攻擊后，對系統(tǒng)性感染的小鼠有很好的免疫保護作用，延長了小鼠的存活時間，降低了病死率。另外，將免疫過的小鼠血清轉(zhuǎn)移給未免疫的小鼠后，可將免疫保護作用轉(zhuǎn)移。同時他們將此疫苗給家兔陰道內(nèi)接種和鼻內(nèi)接種，獲得了相似的效果，陰道液中均檢測到了高滴度的抗β-葡聚糖的IgG抗體，對陰道的念珠菌病有很好的保護作用。Lam-CRM免疫血清及抗 -葡聚糖的單克隆抗體可以體外抑制真菌菌絲的生長。綜上所述，Lam-CRM這種糖結(jié)合疫苗不僅可以預(yù)防念珠菌病，還可以用于治療。是一種預(yù)防性與治療性相結(jié)合的與病原體無關(guān)的有前景的新型疫苗形式。

6 DNA疫苗

DNA疫苗目前不僅是抗感染疫苗研究的熱點，也是基因治療研究的熱點。已知在多種微生物感染疫苗的研究中，DNA疫苗在動物體內(nèi)都產(chǎn)生了較好的免疫效果，如結(jié)核桿菌疫苗、乙型肝炎病毒疫苗等，它既可以誘導(dǎo)體液免疫又可誘導(dǎo)細胞免疫。比較而言，DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫中細胞免疫較強。白色念珠菌感染是多途徑的，針對不同菌體抗原的免疫產(chǎn)生的效果不同。對于機體而言，清除真菌是最重要的。Raska等以Hsp90為抗原，比較了Hsp90的蛋白免疫和DNA免疫對預(yù)防系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠的免疫效果。他們從臨床分離的白色念珠菌中克隆出Hsp90的mRNA，轉(zhuǎn)化成cDNA后克隆至pVAXl載體上，以肌內(nèi)注射和皮內(nèi)注射2種方式免疫小鼠，與相應(yīng)重組蛋白免疫作比較。皮內(nèi)注射DNA的小鼠對白色念珠菌的感染有保護作用，體內(nèi)抗Hsp90的IgG抗體水平與小鼠存活率呈正相關(guān)。而肌內(nèi)注射組對系統(tǒng)性念珠菌感染沒有保護性。

綜上所述，不同形式的白色念珠菌疫苗應(yīng)用都具有很好的免疫保護作用，但目前以Hsp90和Alslp為靶點的白色念珠菌疫苗還處在動物實驗研究階段，以MP65為靶點的疫苗還處在體外實驗研究階段，因此距離臨床應(yīng)用還有大量的工作要做。但從白色念珠菌感染過程中的關(guān)鍵分子和步驟入手，研究和開發(fā)一種既能激活固有性免疫，又能誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的疫苗，對預(yù)防越來越廣泛的白色念珠菌病，以及提高AIDS患者抗真菌感染的能力和生存能力都具有重要意義。

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