劉江寧，張連峰，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

人腸道病毒71型動物模型研究進(jìn)展

劉江寧1，張連峰1，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

人腸道病毒71型是嬰幼兒手足口病的致病原之一，其嚴(yán)重的并發(fā)癥可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至死亡，是近期威脅中國兒童健康的因素之一。目前尚無臨床疫苗可以預(yù)防該病毒感染，而EV71的動物模型是進(jìn)行致病機(jī)理、疫苗評價(jià)和藥物等研究的基礎(chǔ)。本文對EV71的兩種常用動物模型:小鼠和獼猴(Macaca mulatta)模型進(jìn)行了描述，并對其在研究中的應(yīng)用給與概括，為研究者選擇合適的動物模型提供了依據(jù)。

人腸道病毒71型;手足口病;模型，動物

1969年，研究者首次從患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離得到腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，Schmidt等［1］1974年鑒定。EV71病毒屬于微小病毒科腸道病毒屬，為單股正鏈RNA病毒［2］。1974年以來，EV71病毒曾在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)，主要引起嬰幼兒(0～6歲)手足口病(HFMD)和無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致的肺水腫、肺出血和心肌炎，使其致殘和病死率較高。每次疫情暴發(fā)，均會奪走許多嬰幼兒的生命［3］。到目前為止，臨床上尚無預(yù)防EV71病毒感染的疫苗或針對性治療藥物，理想的動物模型是解決以上問題的關(guān)鍵之一，本綜述對EV71病毒在中國的流行特點(diǎn)，現(xiàn)有的動物模型及其應(yīng)用進(jìn)行了概括。

1 EV71病毒流行特點(diǎn)及中國疫情

根據(jù)病毒的VP1基因序列，EV71可分為A、B和C三種基因型，包含A、B1－B5和C1－C5共11個(gè)亞型［4］。在1997～2005年馬來西亞的暴發(fā)中，重癥EV71感染以C1、C2、B3、B4和B5亞型為主［4］。在1999～2007年，澳大利亞的重癥EV71感染以C1亞型為主［5］。2004年臺灣首次出現(xiàn)了C4亞型毒株的流行，2006～2007年間，臺灣的EV71暴發(fā)以B5和C5亞型為主［6］。而中國的EV71暴發(fā)主要以C4亞型為主，偶爾有C5亞型感染的報(bào)道［7］。EV71不同型毒株之間，在毒力方面并無明顯差異，各種基因型的EV71均有引發(fā)嚴(yán)重癥狀的報(bào)道［8］。

1997年以來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢［4，6，7］。1981年，我國在上海發(fā)現(xiàn)手足口病，隨后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、廣東和安徽等十幾個(gè)省(市)相繼出現(xiàn)疫情。2008年EV71導(dǎo)致的手足口病疫情在多個(gè)省市暴發(fā)，2009年1～4月，全國累計(jì)報(bào)告手足口病例115 618例，重癥773例，死亡50例，由于死亡的都是嬰幼兒，引起很大的社會恐慌。李仁清等［9］分析了北京2006～2008年間的流行毒株的序列，發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)流行的EV71仍然是C4亞型，并且在同一時(shí)期的不同地區(qū)、不同來源和不同疾病狀態(tài)下分離的毒株在VP1序列上無明顯差別。但是隨著時(shí)間推移，核苷酸變異的不斷積累，有出現(xiàn)新亞型毒株的可能。

2 EV71病毒的動物模型

2.1 小鼠模型

EV71感染的1日齡新生ICR或BALB/c小鼠是最為常見的EV71模型動物。臨床分離毒株對肌肉組織的噬性高于腦組織，臨床分離株經(jīng)過小鼠體內(nèi)扶強(qiáng)后，可以引發(fā)神經(jīng)癥狀，甚至可以感染1周齡或兩周齡的小鼠。

Chumakov等［10］使用B1亞型的保加利亞臨床分離株感染1日齡的新生小鼠，可引發(fā)癱瘓和肌炎及肌纖維壞死。Arita等［11］將B1亞型的EV71毒株在NOD/SCID小鼠顱內(nèi)傳代扶強(qiáng)，分離到了一株NOD/SCID小鼠適應(yīng)毒株，該毒株感染3～4周齡的NOD/SCID小鼠后，可以使其表現(xiàn)出后肢麻痹。

Chua等［12］將B3亞型的澳大利亞臨床分離株在BALB/c小鼠顱內(nèi)扶強(qiáng)，扶強(qiáng)后的毒株感染1～7日齡BALB/c小鼠，引發(fā)了嚴(yán)重的致死癥狀，骨骼肌是病毒的主要復(fù)制位點(diǎn)，病毒侵染引發(fā)嚴(yán)重的壞死性肌炎。Chan等［13］用B3和B4亞型的EV71作為出發(fā)毒株，建立了1日齡ICR小鼠的感染模型，對小鼠進(jìn)行顱內(nèi)病毒感染后，小鼠均出現(xiàn)明顯的體重增長減緩，而B3亞型毒株感染2 d后可觀察到嗜睡和運(yùn)動不協(xié)調(diào)癥狀，部分小鼠四肢腫脹并伴隨死亡，未發(fā)現(xiàn)后肢麻痹癥狀，而未死亡的小鼠在感染6 d后，上述癥狀全部消失，恢復(fù)正常。Chen等［14］用C2亞型的小鼠適應(yīng)株通過灌胃感染1日齡的ICR小鼠，2 d后，小鼠可出現(xiàn)皮膚病變，一般在4～7 d后出現(xiàn)后肢麻痹，7～9 d后死亡，病理觀察發(fā)現(xiàn)了腦部的淋巴細(xì)胞浸潤。隨后，Wang等［15］將上述C2亞型毒株在1日齡的ICR小鼠顱內(nèi)4次傳代扶強(qiáng)后，得到MP4菌株。扶強(qiáng)菌株在體內(nèi)外的毒力均比出發(fā)菌株增強(qiáng)，且扶強(qiáng)后的毒株可通過灌胃法感染7日齡ICR小鼠，導(dǎo)致其后肢麻痹，并在5～9 d內(nèi)死亡。病理觀察到了感染小鼠的腦干與脊髓中神經(jīng)元消失和凋亡，四肢肌肉大面積壞死。感染早期，可在小鼠的小腸內(nèi)檢測到病毒復(fù)制，而病毒的主要復(fù)制位點(diǎn)是在肌肉、脊髓與腦中。同時(shí)，MP4感染小鼠后，可發(fā)生同窩之間的交叉感染現(xiàn)象。

Ong等［16］使用B3亞型的小鼠適應(yīng)株，通過灌胃與注射感染2周齡的ICR小鼠，小鼠感染后表現(xiàn)出腦脊髓炎等與人類似的神經(jīng)癥狀，感染小鼠的前角神經(jīng)元、三叉神經(jīng)運(yùn)動核和腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元中病毒數(shù)量最多，腦的其他部位也有少量的神經(jīng)元被感染。該模型是迄今為止，能感染EV71病毒的年齡最大的正常小鼠。Wu等［17］將新分離的EV71的neu毒株在Vero細(xì)胞中進(jìn)行兩輪培養(yǎng)，得到Y(jié)N3毒株，其通過腹腔感染新生ICR小鼠時(shí)表現(xiàn)出較高的毒力，可致新生的ICR小鼠后肢麻痹，最終死亡。

中國大陸地區(qū)的EV71流行株主要屬于C4亞型，而實(shí)驗(yàn)動物普遍對該毒株不敏感，導(dǎo)致多數(shù)病毒株感染動物后，不能表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。朵建英等［18］通過腹腔注射對1日齡的ICR小鼠進(jìn)行病毒感染，隨后在腦、肺、骨骼肌與小腸中檢測到了病毒復(fù)制，繪制了病毒在骨骼肌內(nèi)的復(fù)制曲線，并聯(lián)合組織的病理變化，建立了我國流行的C4亞型毒株的小鼠模型。

2.2 非人靈長類模型

口服EV71病毒不能使獼猴產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，獼猴免疫與攻毒多使用椎管或靜脈注射接種［19，20］。Chumakov等［10］使用保加利亞臨床分離株感染獼猴之后，可使獼猴發(fā)生癱瘓，神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)類似于脊髓灰質(zhì)炎的病變。Nagata等［19］分別用5種EV71的臨床分離株(患者分別患有腦炎，腦膜炎和手足口病)，通過椎管注射對獼猴(5～13歲，成年雌性)進(jìn)行病毒感染，1～6 d后，獼猴均表現(xiàn)出了神經(jīng)癥狀:遲緩性麻痹、震顫和共濟(jì)失調(diào)，免疫組化證實(shí)了病毒在脊髓、腦干、小腦皮層、齒狀核和大腦中的復(fù)制。隨后，Nagata等［20］進(jìn)一步建立了靜脈注射感染獼猴的模型，獼猴(6～17歲，成年雌性)感染病毒后，具有與人腦炎類似的臨床體征與神經(jīng)病理表現(xiàn)，包括震顫、共濟(jì)失調(diào)和腦水腫，但沒有發(fā)生諸如肺水腫和心臟衰竭之類的神經(jīng)源性并發(fā)癥。值得注意的是，許多EV71病毒的臨床分離株對獼猴感染時(shí)，表現(xiàn)出了較低的神經(jīng)毒性［21］。國內(nèi)未見使用猴建立感染模型的報(bào)道。

3 動物模型的應(yīng)用

3.1 病毒在體內(nèi)的傳遞及致病機(jī)制研究

病毒在體內(nèi)的傳播途徑，是發(fā)病機(jī)制研究的焦點(diǎn)之一。Chen等［14］用C2亞型小鼠適應(yīng)株通過灌胃感染小鼠，組織內(nèi)病毒滴度實(shí)驗(yàn)表明，病毒首先在小腸內(nèi)復(fù)制并引發(fā)病毒血癥，隨后依次傳播到脊髓的胸段、頸段和腦干中，推測病毒利用逆向軸突的傳遞的方式進(jìn)入腦內(nèi)復(fù)制，這一點(diǎn)與脊髓灰質(zhì)炎病毒類似。隨后，Chen等［22］通過灌胃、肌內(nèi)注射和顱內(nèi)注射三種方式對7日齡小鼠進(jìn)行感染后，均導(dǎo)致腦部感染、松弛型麻痹、肺功能失調(diào)和死亡。然而，不同的感染方式影響了疾病進(jìn)展和發(fā)生神經(jīng)癥狀的概率，與其他兩種感染方式相比，顱內(nèi)注射感染，可導(dǎo)致小鼠的死亡提前發(fā)生，表明從病毒接種到病毒傳遞到顱內(nèi)的時(shí)間長短，決定了疾病發(fā)生的潛伏期長短。雖然灌胃感染可引發(fā)病毒血癥，但是不引發(fā)明顯的神經(jīng)癥狀，預(yù)示著血液運(yùn)輸并不是病毒傳遞的主要方式。后肢感染病毒后，首先會在脊髓的腰段檢測到病毒，隨后傳遞到脊髓的頸段，最后抵達(dá)腦部;而上肢感染病毒后，則首先在脊髓的頸段檢測到病毒，從而得出EV71病毒依賴神經(jīng)元逆向傳遞的結(jié)論。Ong等［16］發(fā)現(xiàn)，通過肌內(nèi)注射感染2周齡小鼠，病毒進(jìn)入骨骼肌后，通過運(yùn)動神經(jīng)感染附近的中樞神經(jīng)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)傳遞。

關(guān)于EV71病毒的致病機(jī)理，目前尚不清楚。病毒感染引發(fā)的嚴(yán)重神經(jīng)癥狀，普遍被認(rèn)為是病毒在腦組織的復(fù)制引起的。然而，隨后的解剖數(shù)據(jù)表明，許多患者體內(nèi)的病毒復(fù)制與病變部位并不一致，并推測宿主免疫系統(tǒng)在發(fā)病過程中扮演了重要的角色［23］。Hashimoto等［24］用臨床分離的毒株經(jīng)皮下注射感染獼猴，結(jié)果一半的獼猴感染后表現(xiàn)出臨床癥狀:后肢麻痹或衰弱。病理分析發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)和血管的病變，以及脊髓、延髓、大腦和腦干灰質(zhì)中的神經(jīng)元變性消失和炎細(xì)胞侵潤。但是，在這些部位均未發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制，而血清中EV71抗體的濃度卻顯著升高，這預(yù)示著除了病毒復(fù)制以外，可能存在其他致病機(jī)制，如免疫過激或交叉免疫反應(yīng)等［25］。

3.2 疫苗評價(jià)

預(yù)防EV71病毒感染的疫苗，均處于研究階段，目前尚無臨床上可以使用的疫苗。獼猴模型中，因?yàn)榭梢愿腥静《镜墨J猴年齡較高，可以用做疫苗的自體免疫評價(jià)。Arita等［26］使用減毒的A型EV71病毒做為疫苗，對獼猴進(jìn)行免疫，45 d后經(jīng)靜脈注射進(jìn)行攻毒，免疫后的獼猴沒有表現(xiàn)出癥狀，且其血清對不同亞型的EV71毒株(A、B1、B4、C2和C4)具有廣譜性的中和作用。然而，從減毒毒株接種的獼猴脊索中，分離到了活病毒，表明弱毒株仍具有一定的神經(jīng)侵染性，并引發(fā)了獼猴的震顫等微弱的神經(jīng)癥狀。

由于小鼠對EV71病毒的敏感期較短，限制了其在疫苗評價(jià)中的使用。目前，國際上多采用對雌鼠或母鼠免疫，疫苗產(chǎn)生的抗體可以通過胎盤屏障傳遞給幼鼠，隨后對幼鼠進(jìn)行病毒感染，從而間接的評價(jià)母源抗體對幼鼠的保護(hù)作用。使用此類方法評價(jià)的疫苗，包括滅活的病毒、病毒結(jié)構(gòu)類似物、VP1蛋白及VP1的DNA疫苗。Wu等［17］比較了滅活全病毒疫苗、VP1的DNA疫苗和VP1蛋白對雌鼠免疫后，母源抗體對幼鼠的保護(hù)能力。雌鼠經(jīng)滅活病毒免疫后，再交配產(chǎn)下的的幼鼠，經(jīng)2300LD50的病毒劑量感染時(shí)，存活率達(dá)到80%，而母鼠經(jīng)VP1蛋白的DNA疫苗和VP1蛋白免疫后產(chǎn)下的的幼鼠，在230 LD50的病毒劑量感染時(shí)，存活率分別為40%和80%，指出滅活全病毒作為疫苗具有最佳的保護(hù)效果。Chung等［27］表達(dá)并純化了EV71病毒類似物—VLP，VLP模仿了全病毒的形狀、衣殼蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白組成。免疫后的BALB/c母鼠產(chǎn)下的幼鼠，在受到EV71病毒(1000 LD50)攻擊時(shí)，存活率可以達(dá)到89%，其保護(hù)活性大于變性的VLP蛋白和熱滅活的EV71病毒。

Ong等［28］使用2周齡ICR小鼠的感染模型，對甲醛滅活的全病毒疫苗進(jìn)行了自體免疫評價(jià)。對1日齡的新生鼠進(jìn)行初次免疫，7 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫7 d后的幼鼠進(jìn)行病毒感染，結(jié)果均未表現(xiàn)出癥狀，各組織也未檢測到病毒。

3.3 藥物篩選

抑制EV71病毒的藥物研究，多處于細(xì)胞水平上，在動物模型中對于藥物治療效果進(jìn)行驗(yàn)證的報(bào)道并不多見，概因?yàn)楦腥静《镜挠资蟠嬖谀挲g過低、感染周期短和不宜進(jìn)行給藥等缺點(diǎn)。Li等［29］對12～14 d的ICR小鼠進(jìn)行腹腔注射感染病毒，感染后2 h開始腹腔注射利巴韋林藥物，每日劑量為100 mg/(kg·bw)，持續(xù)給藥9 d，發(fā)現(xiàn)利巴韋林可以通過抑制組織內(nèi)的病毒復(fù)制，來降低小鼠在面臨病毒感染時(shí)的發(fā)病率、致死率(致死率降低到30%)和麻痹后遺癥。Liu等［30］研究了I型IFNs對病毒感染的幼鼠的治療效果，對3日齡的ICR小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，感染2～3 d后注射地塞米松(I型IFNs的抑制劑)，會加劇臨床癥狀，增加組織內(nèi)病毒滴度。而在病毒感染前12 h注射IFN素的誘導(dǎo)劑，則會提高成活率和降低組織內(nèi)病毒滴度。注射I型IFN的抗體，則會提高死亡率和組織內(nèi)病毒滴度。并且，在感染病毒后的3 d內(nèi)，連續(xù)3 d注射IFN－αA，則會使幼鼠存活。Weng等［31］發(fā)現(xiàn)，牛乳鐵蛋白在小鼠體內(nèi)具有抗病毒效果，它可以延緩麻痹，降低死亡率。但是治療組的死亡率依然達(dá)到了70%，表明其體內(nèi)治療效果微弱。

4 展望

EV71病毒被認(rèn)為是脊髓灰質(zhì)炎病毒被撲滅后，目前最重要的嗜神經(jīng)性腸道病毒。然而，由于該病毒的流行地區(qū)主要是經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的亞太地區(qū)，不能引起發(fā)達(dá)國家的足夠重視，導(dǎo)致其研究進(jìn)展不夠迅速。關(guān)于EV71病毒感染的致病機(jī)理，目前尚不清楚;沒有臨床上可以使用的疫苗和針對性治療藥物，使疫情在很長時(shí)間內(nèi)難以得到緩解，而解決上述問題的關(guān)鍵，是建立理想的模型。猴模型雖然可以滿足上述要求，但是價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模藥物篩選研究;目前小鼠的感染年齡過低，感染周期短，限制了其在疫苗的自體免疫評價(jià)和藥物篩選中的應(yīng)用。而進(jìn)一步提高可感染病毒的小鼠年齡，甚至建立成年小鼠的感染模型，有望解決上述問題。

中國大陸地區(qū)手足口病疫情的病源主要是C4亞型毒株，但是，該亞型的毒株對于實(shí)驗(yàn)動物普遍敏感性不高，導(dǎo)致目前尚未見可以使被感染動物發(fā)病，甚至死亡的模型報(bào)道。進(jìn)一步提高病毒對動物的噬性，或改善動物對病毒的敏感性，有望解決這一問題。

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Hum an Enterovirus 71 Infection in Experim ental anim als

LIU Jiang－ning1，ZHANG Lian－feng1，2

(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical Collage(PUMC)，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，CAMS＆Comparative Medicine Centre，PUMC，Beijing 100021)

Human enterovirus 71(EV71)is one of the major pathogens causing hand，foot and mouth disease in children.The serious complications can lead to neurological symptoms and even death.EV71 is one of the factors threatening the health of Chinese children recently.However，there is currently no vaccine available to prevent clinical infection of this virus.As anim l models are the foundation for pathogenesis studies，vaccine and drug research on EV71 infection，in this paper，two commonly used animal model for EV71，mouse and rhesus monkey，are described and their applications in research are summarized.，to provide fundamentall information for researchers in selection of a suitable animal model.

Human Enterovirus 71;Hand，foot and mouth disease;Model，animal

R－322

A

1005－4847(2010)03－S5－05

2010－04－14

十一五傳染病專項(xiàng)支持(2009ZX10004－402)。

劉江寧(1981－)，助理研究員，研究方向:傳染病的動物模型。E－mail:ljn_zb03038@126.com

張連峰。E－mail:Zhanglf@cnilas.org