馬玉超 李志茹 趙國(guó)柱 彭霞薇 何曉青 謝響明

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

微生物學(xué)是一門(mén)理論性和實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科,實(shí)踐教學(xué)是不可或缺的重要環(huán)節(jié)[1]?，F(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)必修的一門(mén)基礎(chǔ)課程,該課程對(duì)于培養(yǎng)研究生的操作能力、科研能力、創(chuàng)新能力和提高研究生的綜合素質(zhì)具有重要的作用。熟練掌握現(xiàn)代微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)是順利開(kāi)展課題研究的基礎(chǔ),更是將來(lái)面向社會(huì)就業(yè)的專(zhuān)業(yè)技能[2]。當(dāng)代的微生物學(xué)利用生物技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等武器在人類(lèi)的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著巨大的作用[3]。變廢為寶、化腐朽為神奇力量的微生物越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品及環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域[4],這一新形式給大批基礎(chǔ)扎實(shí)、知識(shí)面廣、專(zhuān)業(yè)技術(shù)強(qiáng)、高素質(zhì)的微生物專(zhuān)業(yè)人才提供了展示才華的良機(jī);同時(shí)也對(duì)研究生現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法提出了更高的要求。

一、研究生現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問(wèn)題

北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院研究生微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原分配學(xué)時(shí)為20學(xué)時(shí),由于學(xué)時(shí)的限制,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由噬菌體轉(zhuǎn)染、土壤樣品中基因組DNA的提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備等幾個(gè)獨(dú)立的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目組成。鑒于以上情況,在教學(xué)過(guò)程中存在實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間聯(lián)系不夠緊密、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多以驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為主、缺乏探索性和創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)等問(wèn)題,不能激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,不利于培養(yǎng)研究生的科研思維和創(chuàng)新精神,從而嚴(yán)重影響了教學(xué)效果和教學(xué)質(zhì)量。因此對(duì)研究生微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)思路的調(diào)整和教學(xué)內(nèi)容的改革迫在眉睫。

二、研究生現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革思路

研究生教育的一個(gè)重要目的是培養(yǎng)研究生獨(dú)立從事科學(xué)研究的能力?？蒲心芰κ强茖W(xué)素質(zhì)的核心,是人們運(yùn)用已有知識(shí)和科學(xué)方法去探索新知識(shí)、解決新問(wèn)題的過(guò)程中所形成的各種心理品質(zhì)和能力,它是研究生應(yīng)具備的最基本能力[5]?，F(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究生專(zhuān)業(yè)教育的一個(gè)重要過(guò)程,必須注意培養(yǎng)研究生獨(dú)立科研的能力。因此,新的教學(xué)改革方案需要在增加現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課時(shí)的基礎(chǔ)上,遵循基礎(chǔ)性、應(yīng)用性、前沿性、創(chuàng)新性和綜合性的原則設(shè)計(jì)一套完整的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。讓學(xué)生在理解實(shí)驗(yàn)原理、增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)操作能力的基礎(chǔ)上,從中領(lǐng)會(huì)到課題開(kāi)展之前文獻(xiàn)調(diào)研的重要性,如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)方法、以及如何對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析等,以培養(yǎng)學(xué)生的科研思路和創(chuàng)新精神,強(qiáng)化學(xué)生的綜合素質(zhì)和實(shí)踐能力,從而為順利完成課題研究奠定基礎(chǔ),為將來(lái)面向社會(huì)就業(yè)增強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力。

三、現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革

(一)實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程的改革

實(shí)驗(yàn)由新入學(xué)的2008級(jí)研究生共40人在北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院微生物教研室全體教師指導(dǎo)下完成,研究生教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心為實(shí)驗(yàn)提供場(chǎng)地,研究生院提供購(gòu)買(mǎi)儀器設(shè)備和試劑的費(fèi)用。實(shí)驗(yàn)班由原來(lái)的30人改為20人,實(shí)驗(yàn)組由原來(lái)6人一組改為4人一組,給予學(xué)生更多的操作空間,減少相互間的干擾,既充分給予學(xué)生動(dòng)手的機(jī)會(huì),又使他們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中能相互討論、互相協(xié)作、互相監(jiān)督、取長(zhǎng)補(bǔ)短,保證動(dòng)手機(jī)會(huì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有機(jī)統(tǒng)一,以提高教學(xué)質(zhì)量。課時(shí)由原來(lái)的20學(xué)時(shí)改為32學(xué)時(shí),每次4學(xué)時(shí),每周2次,共上4周,教師根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和學(xué)生的情況靈活掌握。

(二)教學(xué)過(guò)程設(shè)計(jì)

分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展對(duì)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的滲透,極大地豐富了其內(nèi)容并將其推進(jìn)到一個(gè)新的發(fā)展階段。針對(duì)微生物及學(xué)科發(fā)展的特點(diǎn),我們從微生物菌種鑒定、功能基因克隆、代謝途徑解析、微生物育種及微生物細(xì)胞的高密度培養(yǎng)等幾個(gè)大的方面出發(fā),設(shè)計(jì)了連續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,但大范圍的實(shí)驗(yàn)需要分段、按課時(shí)實(shí)施。我們將整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程拆分為5個(gè)小實(shí)驗(yàn),使之盡量具有可分段操作性,在需要連續(xù)操作時(shí)又可靈活掌握。限于學(xué)時(shí),在設(shè)計(jì)教學(xué)過(guò)程時(shí),我們遵循的另一個(gè)原則是教師講解與學(xué)生動(dòng)手相結(jié)合。具體來(lái)說(shuō),就是教師的講解要充分體現(xiàn)出一個(gè)比較完整的科研思路,學(xué)生動(dòng)手操作其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),讓學(xué)生在掌握具體實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中充分了解實(shí)驗(yàn)的目的和應(yīng)用范圍。我們以產(chǎn)植物生長(zhǎng)激素IAA的固氮菌為研究對(duì)象,通過(guò)菌種鑒定、TAIL-PCR擴(kuò)增已知部分基因側(cè)翼未知序列、轉(zhuǎn)座子隨機(jī)敲除法解析IAA代謝途徑、全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程提高IAA產(chǎn)量、重組微生物細(xì)胞發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)等完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程,使學(xué)生得到一個(gè)完整的、綜合性的訓(xùn)練。

1.菌種鑒定

菌種鑒定是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),在本科階段,微生物學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)的學(xué)生已經(jīng)實(shí)踐過(guò)生理生化、革蘭氏染色、細(xì)胞大小的測(cè)量和細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察等實(shí)驗(yàn)。但是,對(duì)菌種鑒定并沒(méi)有一個(gè)完整的認(rèn)識(shí)(根據(jù)課上調(diào)查結(jié)果)。因此,我們主要針對(duì)如何鑒定微生物菌種這一主題向?qū)W生進(jìn)行講解,包括16S rRNA基因序列分析、DNA-DNA雜交、細(xì)胞脂肪酸含量分析、生理生化實(shí)驗(yàn)等。對(duì)于前三者的原理、實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹、對(duì)于后者進(jìn)行簡(jiǎn)要的說(shuō)明。學(xué)生實(shí)踐內(nèi)容為16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增,然后送公司進(jìn)行DNA測(cè)序。序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建為學(xué)生課后根據(jù)老師講解的方法自行完成。此實(shí)驗(yàn)安排在4學(xué)時(shí)內(nèi)完成。

2.TAIL-PCR擴(kuò)增已知部分基因的未知側(cè)翼序列

微生物學(xué)是一門(mén)應(yīng)用性非常強(qiáng)的學(xué)科,對(duì)微生物的利用主要是對(duì)微生物細(xì)胞、微生物基因及微生物基因編碼的蛋白的利用。因此微生物基因克隆在現(xiàn)代微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革中是一個(gè)非常重要的內(nèi)容。我們針對(duì)微生物基因的克隆方法及已知部分基因序列的情況下如何克隆全長(zhǎng)基因進(jìn)行詳細(xì)講解,如簡(jiǎn)并 PCR、功能互補(bǔ)、Sourthern雜交、TAILPCR、反向PCR等。學(xué)生主要的操作內(nèi)容為在已知固氮酶編碼基因 nifH部分序列的情況下,采用TAIL-PCR[6]的方法進(jìn)行全長(zhǎng)基因的克隆。TAIL-PCR技術(shù)是基于PCR技術(shù)衍生出來(lái)的一種在已知部分基因序列情況下,克隆未知側(cè)翼序列的快速、有效、省時(shí)省力的方法。因此理解此技術(shù)的原理、熟練掌握其操作方法對(duì)于多數(shù)研究生的課題研究都會(huì)有所幫助。此實(shí)驗(yàn)安排在6學(xué)時(shí)內(nèi)完成。

3.轉(zhuǎn)座子隨機(jī)敲除法解析IAA代謝途徑

20世紀(jì)50年代初期,美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室遺傳育種學(xué)家McClintock通過(guò)對(duì)玉米籽粒色斑不穩(wěn)定現(xiàn)象的研究而發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座現(xiàn)象,首次發(fā)現(xiàn)了能在基因組內(nèi)不同區(qū)域轉(zhuǎn)移的控制成分。它可以從遺傳物質(zhì)的一部分跳躍到另一部分,從而引起遺傳變異,近年來(lái)已發(fā)展為研究微生物物質(zhì)代謝途徑的一種簡(jiǎn)便、有效的遺傳工具。我們向?qū)W生詳細(xì)講解了轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)理、含轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pRF1063a的構(gòu)建思路和使用方法,讓學(xué)生將含有pRF1063a質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1/pRF1063a通過(guò)接合的方式轉(zhuǎn)入產(chǎn)IAA的巴西固氮螺菌sp7中,進(jìn)而篩選IAA產(chǎn)量發(fā)生變化的突變株,再通過(guò)轉(zhuǎn)座子定位IAA代謝途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因。此實(shí)驗(yàn)充分體現(xiàn)了現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)在微生物學(xué)領(lǐng)域的滲透。此實(shí)驗(yàn)安排在6學(xué)時(shí)內(nèi)完成。由于實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間零散,周期較長(zhǎng),完成一輪實(shí)驗(yàn)需要大約1周的時(shí)間,因此實(shí)驗(yàn)在具體安排上存在很大困難。但是,學(xué)生們毫無(wú)怨言地克服了困難,而且熱情很高,這一點(diǎn)充分體現(xiàn)了學(xué)生們非?？释麑W(xué)習(xí)到與時(shí)俱進(jìn)和實(shí)用型的新技術(shù)、新理論。

4.全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程法提高菌株植物生長(zhǎng)激素IAA產(chǎn)量

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控是2006年美國(guó)麻省理工大學(xué)的Alper等首次提出[7]的一種全新的改進(jìn)細(xì)胞表型的定向進(jìn)化方法,通過(guò)error-prone PCR、DNA shuffling等技術(shù)對(duì)細(xì)胞中的σ因子和其他轉(zhuǎn)錄原件進(jìn)行多輪突變修飾,改變RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率和對(duì)啟動(dòng)子的親和能力,使細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄在整體水平上發(fā)生變化,導(dǎo)致許多由多種基因控制的細(xì)胞表型得以?xún)?yōu)化。本課程的主講教師應(yīng)用此法改善了紅球菌對(duì)丙烯酰胺的耐受性。我們有這方面的工作經(jīng)驗(yàn),所以可以充分提供學(xué)生實(shí)驗(yàn)的素材,讓學(xué)生了解微生物細(xì)胞遺傳改造的先進(jìn)理論和方法。此實(shí)驗(yàn)安排在8學(xué)時(shí)內(nèi)完成,具體時(shí)間會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況和學(xué)生的情況有所調(diào)整。

5.發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用

發(fā)酵在微生物開(kāi)發(fā)利用方面起到至關(guān)重要的作用。由于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)本身存在一些特殊的性質(zhì)(大型儀器數(shù)量少、不適合開(kāi)展大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)教學(xué)),所以,微生物相關(guān)專(zhuān)業(yè)的本科學(xué)生一般沒(méi)有接觸到這方面的實(shí)際操作。但是,大多數(shù)學(xué)生為完成碩士研究生課題研究又需要熟練掌握這一技術(shù)。因此,針對(duì)這一情況,我們?cè)O(shè)計(jì)了此實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。我們向?qū)W生詳細(xì)講解發(fā)酵罐的組成、詳細(xì)的使用方法及注意事項(xiàng),讓學(xué)生獨(dú)立操作完成發(fā)酵巴西固氮螺菌sp7生產(chǎn)植物生長(zhǎng)激素IAA的整個(gè)過(guò)程。此實(shí)驗(yàn)安排在8學(xué)時(shí)內(nèi)完成。

5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)一個(gè)完整的科研思路。在具有一個(gè)有特定功能(產(chǎn)植物生長(zhǎng)激素并能夠固氮)的微生物的情況下,如何鑒定微生物的菌種、如何研究其代謝途徑、如何克隆功能基因、如何提高其產(chǎn)量、又如何大規(guī)模高密度培養(yǎng),是完成微生物從理論研究到實(shí)際應(yīng)用所必經(jīng)的科研思路。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)方面我們的獨(dú)特之處是內(nèi)容與時(shí)俱進(jìn)、與教師的科研課題相結(jié)合。同時(shí),教師們最大的感受是,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的新穎性和先進(jìn)性及學(xué)生的需求是激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的最重要因素。碩士研究生要在3年內(nèi)完成研究課題,需要尋找一些與專(zhuān)業(yè)相關(guān)的先進(jìn)有效的技術(shù)方法和理論。因此,對(duì)于剛剛本科畢業(yè)的學(xué)生來(lái)說(shuō),此課程具有極大的吸引力。

(三)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰己说母母?/h3>

我們?cè)O(shè)計(jì)了既能督促學(xué)生又能充分考察學(xué)生綜合能力的考核方式,主要由以下3部分組成:①平時(shí)出勤情況、動(dòng)手操作能力占 10%;②實(shí)驗(yàn)報(bào)告占60%;③實(shí)驗(yàn)匯報(bào)占30%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)學(xué)生要簽到;實(shí)驗(yàn)完成后3天內(nèi)交實(shí)驗(yàn)報(bào)告;所有實(shí)驗(yàn)完成1周后,以實(shí)驗(yàn)組為單位進(jìn)行總結(jié)匯報(bào),匯報(bào)內(nèi)容為關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)的原理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析等。通過(guò)這樣一種方式為學(xué)生提供一個(gè)開(kāi)放式交流的機(jī)會(huì),目的是加深學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解和掌握。所謂開(kāi)放式的交流,是指學(xué)生不僅可以討論實(shí)驗(yàn)方面的知識(shí),也可以討論ppt制作、匯報(bào)思路、完成此課程之后的一些感受、學(xué)生們將來(lái)要面對(duì)的科研課題等一切學(xué)生和老師所想到和觀(guān)察到的問(wèn)題。

以上是北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)針對(duì)研究生現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)踐教學(xué)課程進(jìn)行的改革。在實(shí)驗(yàn)思路上,我們根據(jù)研究生教學(xué)大綱和學(xué)生掌握的知識(shí)以及社會(huì)需求等情況進(jìn)行較大的調(diào)整,以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和科研能力為指導(dǎo)方針;實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是結(jié)合教師目前在研和結(jié)題的科研課題以及微生物相關(guān)專(zhuān)業(yè)研究生的培養(yǎng)目標(biāo)制定的,讓學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)最大限度地學(xué)習(xí)到更多的與時(shí)俱進(jìn)的先進(jìn)試驗(yàn)方法和理論。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,學(xué)生們上課積極性非常高,討論異常激烈,教學(xué)效果非常好。

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