鴨甲肝病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

張大丙

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀 100193）

鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要傳染病。近兩年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)該病病原開(kāi)展了分子生物學(xué)研究,本文描述了病原的血清型、分類(lèi)地位、基因組結(jié)構(gòu)、基因組變異性等方面的研究進(jìn)展。

1 血清型及分類(lèi)地位

鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV）是鴨病毒性肝炎的致病病原[1],歷史上被分為3個(gè)血清型(1～3型）,最初均被假定為小 RNA病毒科成員[2-3]。按國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV）第八次分類(lèi)報(bào)告,血清1型(DHV-1）和3型(DHV-3）屬于小RNA病毒科的2個(gè)病毒種[4],而血清2型(DHV-2）屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬的成員,并已被改稱(chēng)為鴨星狀病毒1型(duck astrovirus 1,DA stV-1）[5]。最近的結(jié)果表明,傳統(tǒng)的血清2型和3型均屬星狀病毒[6],應(yīng)從DHV的血清型中排除。

2007年,研究者分別在臺(tái)灣和韓國(guó)鑒定出DHV的新血清型,暫稱(chēng)之為“臺(tái)灣新型”和“韓國(guó)新型”,2個(gè)新型之間的血清學(xué)關(guān)系尚不清楚,但它們均不與DHV-1產(chǎn)生交叉中和反應(yīng)[7-8]。DHV-1、“臺(tái)灣新型”和“韓國(guó)新型”三者之間在衣殼蛋白編碼區(qū)存在較高的變異性(28%～32%的P1核苷酸序列差異和21%～27%的P1氨基酸序列差異）[9],據(jù)此可認(rèn)為它們屬于不同的血清型。

血清1型[10-12]、“臺(tái)灣新型”[7]和“韓國(guó)新型”[8]DHV均具有典型的小RNA病毒基因組結(jié)構(gòu),但它們與小RNA病毒科9個(gè)已知屬病毒之間的衣殼蛋白以及保守的2C和3D蛋白的氨基酸序列同源性均小于40%,應(yīng)被歸屬于小RNA病毒科的一個(gè)新屬,ICTV小RNA病毒研究組建議稱(chēng)之為禽肝病毒屬(avihepatovirus）(http://www.picornaviridae.com）。

按照現(xiàn)有的知識(shí)可認(rèn)為,鴨病毒性肝炎可由小RNA病毒科禽肝病毒屬鴨肝炎病毒的3個(gè)型和星狀病毒科禽星狀病毒屬的2種鴨星狀病毒引起,故在描述該病病原時(shí)易出現(xiàn)混淆:(1）作為星狀病毒[6],DHV-3仍在使用[4]。(2）在ICTV第八次報(bào)告中,DHV-1是一個(gè)病毒種[4],但DHV-1通常又指DHV的血清1型;當(dāng)出現(xiàn)新的血清型時(shí)(如“臺(tái)灣新型”和“韓國(guó)新型”）,傳統(tǒng)的血清1型和新的血清型如何稱(chēng)呼?是將它們稱(chēng)為DHV的不同血清型還是DHV-1的不同血清型?

為避免混淆,可引入一個(gè)新的病毒種名,即鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV）[13],既可與鴨星狀病毒相區(qū)分,亦可與鴨乙肝病毒相對(duì)應(yīng),還便于對(duì)該病毒的不同血清型進(jìn)行命名。因此,作為鴨病毒性肝炎的病原之一,DHAV特指小 RNA病毒科禽肝病毒屬的成員。可用DHAV-1代表傳統(tǒng)的血清1型,如果血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果最終表明“臺(tái)灣新型”和“韓國(guó)新型”缺乏血清學(xué)相關(guān)性,則分別稱(chēng)之為血清2型(DHAV-2）和血清3型(DHAV-3）[13]。進(jìn)化分析中,血清1型、“臺(tái)灣新型”和“韓國(guó)新型”分屬3個(gè)不同的基因型,即 A型(DHAV-A）、B型(DHAV-B）和 C型(DHAV-C）[9]。目前,分子生物學(xué)技術(shù)的運(yùn)用日益廣泛,若用基因型描述DHAV不同毒株的型別更為方便。

2 基因組結(jié)構(gòu)

DHAV有小RNA病毒的基因組基本結(jié)構(gòu),即僅含一個(gè)大的 ORF,其兩側(cè)分別是 5′UTR和3′UTR,3′UTR 之后是poly(A）尾。ORF編碼一個(gè)聚蛋白,從 N端到C端方向,分別為結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(P1）和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(P2和P3）。預(yù)測(cè)P1區(qū)裂解為3種衣殼蛋白(VP0、VP3和VP1）,P2區(qū)裂解為4種或5種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A 1、2A 2或2A 2+2A 3、2B和2C）,P3區(qū)裂解為4種非結(jié)構(gòu)蛋白(3A、3B、3C和3D）[7-8,10-12]。與多數(shù)小 RNA病毒相比,DHAV的基因組有其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),例如VP0缺乏成熟切割、含有不同2A蛋白的組合、擁有小RNA病毒科中最長(zhǎng)的 3′UTR。不同研究者對(duì)IRES的類(lèi)型、L蛋白的有無(wú)和2A蛋白的數(shù)量等3個(gè)方面的分析結(jié)果尚未取得一致的意見(jiàn)。

小RNA病毒的5′UTR至少存在兩個(gè)功能域,其5′端與病毒RNA的復(fù)制有關(guān),3′端則含有與起始蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)的IRES。目前,在小RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了4種不同類(lèi)型的IRES。腸道病毒和鼻病毒的IRES屬于Ⅰ型,口蹄疫病毒、心病毒、人雙埃柯病毒(human parechovirus,HPeV）和ljungan病毒(ljungan virus,LV）的IRES屬于Ⅱ型,甲肝病毒的IRES屬于Ⅲ型,而豬捷申病毒Ⅰ型(porcine teschovirus 1,PTV-1）與黃病毒科丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV）相似,其IRES屬于Ⅳ型。Kim MC等(2006）、Tseng C H 等(2007）和 Tseng C H和Tsai H J(2007）認(rèn)為:DHAV可能與 LV和HPeV類(lèi)似,擁有Ⅱ型IRES[7,11-12]。但Ding C和Zhang D(2007）則認(rèn)為:DHAV的IRES可能屬于Ⅳ型 。其原因是:在DHAV 的 5′UTR 中,存在非典型的 Yn-Xm-AUG基序(Y5-X5-AUG或 Y 7-X71-AUG）,并不符合 Ⅱ型 IRES的特征。比較5′UTR的序列可以發(fā)現(xiàn),對(duì)應(yīng)于Ⅳ型IRES中構(gòu)成Ⅲe域的區(qū)域,DHAV和HCV的12個(gè)堿基完全一致,而DHAV與PTV-1的12個(gè)堿基僅存在一個(gè)堿基的差異。同時(shí),對(duì)應(yīng)于Ⅳ型IRESⅢe域的下游序列及Ⅲ域的上游序列,DHAV的5′UTR序列亦可以互補(bǔ)配對(duì)形成一個(gè)類(lèi)似于HCV和PTV-1Ⅲf域的假結(jié)[10]。

Kim MC 等(2006）、Tseng C H 等(2007）、Tseng C H和Tsai H J(2007）和Kim MC等(2007）認(rèn)為,DHAV基因組ORF的5′端不編碼L蛋白[7-8,11-12],但分析結(jié)果顯示,所有DHAV毒株聚蛋白N端的31-35均為GA/VVES序列,與其他小RNA病毒VP0/VP4蛋白N端的豆寇?；盘?hào)序列(GxxxS/T）相符,因此,Ding C和 Zhang D(2007）預(yù)測(cè)在DHAV的N端存在一個(gè)短的L蛋白,含30個(gè)氨基酸[10]。

和LV類(lèi)似,DHAV的2A蛋白由結(jié)構(gòu)上不同的蛋白組成。Kim MC等(2006）、Ding C和Zhang D(2007）認(rèn)為,DHAV的2A蛋白是由20個(gè)氨基酸的口蹄疫病毒樣2A 1與285個(gè)氨基酸的人雙?？虏《緲?A 2組成,在2A 2的N端存在一個(gè)AIG1保守域[10-11]。和LV的2A 2蛋白相比,DHAV的2A 2蛋白在N端長(zhǎng)出161個(gè)氨基酸,Tseng C H等(2007）、Tseng C H 和 TsaiH J(2007）認(rèn)為,這多出的161個(gè)氨基酸將會(huì)形成一種成熟的蛋白(2A 2）,而剩下的124個(gè)氨基酸則形成另外一種成熟蛋白(2A 3）[7,12]。

3 變異性

根據(jù)衣殼蛋白編碼區(qū)的序列同源性和進(jìn)化分析的結(jié)果,可將DHAV區(qū)分為3個(gè)基因型,Wang L等(2008）稱(chēng)之為A型(DHAV-A）、B型(DHAV-B）和C型(DHAV-C）[9]。在VP1區(qū),型內(nèi)核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥90%和92%,型間核苷酸和氨基酸序列同源性分別≤72%和79%;在VP0區(qū),型內(nèi)核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥92%和96%,型間核苷酸和氨基酸序列同源性分別≤73%和81%;在VP3區(qū),型內(nèi)核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥91%和95%,型間核苷酸和氨基酸序列同源性分別≤74%和83%。說(shuō)明DHAV的衣殼蛋白編碼區(qū)序列在型內(nèi)高度保守,在型內(nèi)具有較高的變異性。

在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū),型內(nèi)序列亦高度保守(核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥91%和94%）,型間情況則有所不同。在核苷酸水平,型間各非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的序列變異性均較高(同源性為67%～85%）;在氨基酸水平,DHAV-B和DHAV-C之間各非結(jié)構(gòu)蛋白的序列均較保守(同源性為90%～97%）,但比較這兩個(gè)基因型與DHAV-A之間的關(guān)系,可見(jiàn)2A和3AB蛋白的氨基酸序列變異性較高(同源性為 70%～77%）,而 2B、2C、3C和 3D蛋白的氨基酸序列則較為保守(同源性為86%～93%）。

兩個(gè)非翻譯區(qū)的核苷酸序列在型內(nèi)亦高度保守(序列同源性≥93%）。在型間,5′UTR序列高度變異(序列同源性為 69%～74%）,對(duì)于 3′UTR,DHAV-B和DHAV-C之間較為保守(序列同源性為89%～92%）,但它們與DHAV-A之間均表現(xiàn)出較高的變異性(序列同源性為63%～70%）。

3個(gè)型DHAV在基因組長(zhǎng)度亦表現(xiàn)出差異。不計(jì)poly(A）尾,DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C的基因組長(zhǎng)度分別為7 689-7 691 nt、7 769 nt和7 773～7 775 nt。不同基因型DHAV基因組長(zhǎng)度差異源于3個(gè)基因區(qū):VP1、5′UTR和3′UTR。

DHAV-A和DHAV-B的VP1長(zhǎng)714 nt,編碼238個(gè)氨基酸的 VP1蛋白[7,10-12],而 DHAV-C的VP1長(zhǎng)720 nt,編碼240個(gè)氨基酸的VP1蛋白[8]。因此,DHAV-C的ORF(6 756 nt）比DHAV-A和DHAV-B的ORF(6 750 nt）長(zhǎng)6個(gè)堿基,編碼的聚蛋白(2 251 aa）比DHAV-A和DHAV-B的聚蛋白(2 249 aa）多2個(gè)氨基酸。

不同基因型之間,5′UTR和3′UTR中存在廣泛的插入/缺失,相對(duì)于 DHAV-A,DHAV-B和DHAV-C的兩個(gè)非翻譯區(qū)更長(zhǎng),而 DHAV-B和DHAV-C的兩個(gè)非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度相似。DHAV-A的5′UTR 和 3′UTR 分別長(zhǎng) 625-626 nt和 314-315 nt[10-12],DHAV-B的5′UTR 和3′UTR 分別長(zhǎng)653 nt和 366 nt[7],而 DHAV-C 的 5′UTR 和3′UTR的長(zhǎng)度分別為651-652 nt和366-367 nt。

4 展望

DHAV分子生物學(xué)研究工作的開(kāi)展對(duì)于確定該病毒的分類(lèi)地位,進(jìn)一步研究該病毒的分子致病機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。DHAV的基因組序列特點(diǎn)則有利于建立快速的分子檢測(cè)和分型方法?；?′UTR部分序列的分析結(jié)果,已確定我國(guó)多個(gè)地區(qū)同時(shí)流行DHAV-A和DHAV-C[13]。進(jìn)一步開(kāi)展DHAV的分子流行病學(xué)研究可較全面的掌握我國(guó)DHAV的血清型/基因型分布,其結(jié)果對(duì)于有效控制我國(guó)鴨病毒性肝炎的發(fā)生和流行具有重要意義。

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