韓春梅,劉建國 ,張 勇

(1.大連工業(yè)大學,遼寧大連 116034; 2.中國科學院 海洋研究所,山東青島 266071; 3.云南愛爾發(fā)生物技術有限公司,云南楚雄 675000)

蝦青素具有多種生物活性,尤其具有極高的抗氧化性,其還原能力是類胡蘿卜素的10倍、維生素E的100～550倍[1],在醫(yī)藥、保健、化妝品、食品以及飼料添加劑等方面都有廣泛的應用前景[2]。雨生紅球藻能積累其干質量1%以上的蝦青素,是目前已知蝦青素含量最高的生物來源,被認為是天然蝦青素的濃縮品[3],其蝦青素構型以 3S,3′S為主[4],與動物體內需求的蝦青素構型基本一致,生物吸收效果較好。因此,培養(yǎng)紅球藻生產蝦青素是國際上藻類學當前研究與開發(fā)關注熱點。

雖然雨生紅球藻研究已日臻完善且已經開展規(guī)?；a,但國外只有美國夏威夷 Aquasearch Inc.,Cyanotech Corporation Hawaii,Micro Gaia Inc.Hawaii和瑞典AstaCarotene AB等少數公司從事紅球藻天然蝦青素批量生產,遠不能滿足市場對天然蝦青素需求。國內實驗室研究相對成熟,規(guī)模化生產正在起步。眾所周知,室內實驗研究與實際生產存在很大差異,前者多側重闡述科學技術問題,實驗規(guī)模很小,培養(yǎng)條件比較容易控制,產業(yè)化規(guī)模通常較大,光照和溫度等關鍵培養(yǎng)條件難于經濟而有效地控制,故需要因地制宜篩選適宜于當地自然環(huán)境變化的藻株。作者結合云南愛爾發(fā)公司具體情況,選取3株分別原產中國、瑞典和挪威的紅球藻,針對云南楚雄地區(qū)光溫季節(jié)性變化開展了相關研究,目的提供篩選適宜于規(guī)?；a的紅球藻藻株的基礎數據,促進該產業(yè)在中國發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種和培養(yǎng)基

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)藻株共 3株,分別編號為H0、H2、H3,全部來自中國科學院海洋研究所藻類與藻類生物技術實驗室。

培養(yǎng)基為MCM的修正配方[5]。

1.2 培養(yǎng)條件方法

將雨生紅球藻接種到5 L的三角燒瓶中,在溫室車間通氣培養(yǎng),按照2.50 L/min氣量通入0.55% CO2加富空氣,補充 CO2消耗和攪拌藻液,以自然漫散光為光源,光照時間隨季節(jié)變化,光照強度隨入射光線角度不同而出現變化,光強相當于直射光能的30%～55%。實驗場地位于北緯25.0°、東經101.5°,海拔1 900 m,根據楚雄當地氣象部門統(tǒng)計其主要氣候資料如表1所示,年均氣溫為15 ℃±2 ℃。

表1 實驗地區(qū)云南楚雄的基礎氣象資料(30年平均)Tab.1 The meteorologic data of Chuxiong,Yunnan during 1971~2000

1.3 細胞數量、細胞大小和比生長速率的計算

在培養(yǎng)期間定時取樣,用血球計數板顯微計數。每一處理至少 2 個樣本,每個樣本重復顯微計數20 次,以平均值±標準差表示。細胞大小利用測微尺測定,每個樣本測定20次,取平均值±標準差表示。

其中,μ為比生長速率,N2是時間T2時的細胞密度,N1是時間T1時的細胞密度。

1.4 葉綠素和蝦青素含量的測定

取一定體積藻液于離心管中,離心后棄上清液,藻渣中加入100%的丙酮研磨。再次離心,將上層色素溶液轉移到容量瓶中,藻渣按上述方法重新萃取,直到藻體成白色為止,色素溶液匯合并定容。采用722S 型分光光度計和 1 cm 光徑的比色杯,分別測定 480、645、663 nm 波長下色素提取液的光吸收值(A值)。依據 Lichtenthaler[6]和 Davies[7]的方法計算蝦青素質量濃度,公式如下：

1.5 葉綠素連續(xù)熒光動力學測定

細胞生長主要發(fā)生在游動細胞階段,而蝦青素積累是在不動細胞階段進行的,細胞轉化是游動細胞向不動細胞轉化和蝦青素累積的關鍵轉變點,觀察不同類型藻株在細胞轉化過程中的光化學特性與光能分配差異,可以很好地解釋為什么不同藻株對不同環(huán)境條件變化的適應存在差異。為此,選擇綠色游動細胞、剛進行細胞轉化還未積累蝦青素的綠色不動細胞、以及已經積累蝦青素的紅色不動細胞進行了對比實驗。

分別取不同株系不同發(fā)育階段(綠色游動細胞、綠色不動細胞和紅色不動細胞)紅球藻藻液 2 mL于測量瓶中,以滅菌培養(yǎng)液為對照,黑布遮光黑暗適應15 min。然后利用英國Hansatech公司Handy Pea便攜式植物效率分析儀,以650 nm波長紅光為光源,按照預先設計的程序測定活藻體連續(xù)激發(fā)熒光的動力學曲線,共測定 16個光照點,每點光照持續(xù)時間2 s,閃爍光強梯度依次為10、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、750、1000、1500、2000 μmol /(m2·s),每點光照之間黑暗10 s,每株紅球藻樣品處理重復 3次,記錄從微秒-毫秒到秒級熒光強度變化,得到OJIP曲線[8,9]。

依Biolyzer軟件對OJIP曲線進行數據分析獲得紅球藻株系的相關光合反應參數。其中：Fm為所有反應中心完全關閉時的熒光,即暗適應后最大熒光強度; PSⅡ最大光化學效率代表可變熒光強度與最大熒光強度的比率;Vj反映了照光2 ms時有活性的反應中心PSⅡ的關閉程度;Vi代表照光30 ms時有活性的反應中心 PSⅡ的關閉程度;T＝0時,電子傳遞量子產額以ET0/ABS表示; ABS/RC代表單位反應中心PSⅡ吸收的光能; TR0/RC代表T0時單位反應中心PSⅡ捕獲的用于還原QA的能量; ET0/RC為T0時單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量; DIo/RC指在T0時單位反應中心耗散掉的能量; DI/ABS為熱耗散能量占吸收能量的比率; PI(abs)為T0時以吸收光能為基礎的性能指數[10]。

表2 不同雨生紅球藻藻株細胞生長的年際變化Tab.2 Year-round changes in cell growth of different strains of H.pluvialis

2 結果與討論

2.1 藻株生長速率的年際變化

對比不同藻株培養(yǎng)過程中細胞大小、細胞數目、葉綠素含量和吸光度等一系列生長指標(表 2),從中可以看出,在旺盛生長的游動細胞階段不同藻株之間大小變化沒有明顯規(guī)律,細胞直徑一般在 24 μm左右,隨季節(jié)交替出現一定幅度波動,在大多數時間(5～11月份共7個月)內,H3細胞直徑相對而言略大些,但在統(tǒng)計學上差別不很明顯,這可能與該藻細胞分裂速度相對較慢有一定關系。

其他不同指標顯示生長方面雖然也存在一定差異,但總體上相互之間呈現很好的正相關性。為更簡單明確地比較藻株生長速率的年際變化規(guī)律,僅選取細胞數目指標進行分析。表 2結果表明,不僅不同藻株生長速率變化很大,而且同一藻株年際變化也很大。其中比生長速率最快時超過 0.6,即每周生物量凈增加26倍; 而比生長速率最慢時不足0.12,每周生物量只增加 1倍多。生長速率最高的藻株在不同的月份中出現的頻率不一樣,其中藻株 H0相對生長較快的時間出現較多,在 1～5月、9月、11～12月份共8個月中藻株H0生長速率都是最高的; 在其余的6～8月和10月份共4個月中,生長較快的藻株為H2; 而藻株H3生長速度在任何時間段都沒有表現出比其他2株紅球藻快。

因此,在生產上春、秋季和冬季選用藻株 H0預期可獲得最大生物量,而在上述季節(jié)中(除4～5月外),無論光照還是溫度在全年中都相對偏弱(表 1),比較適宜于該藻株生長。而在夏季選用藻株H2可獲得更多的紅球藻生物量,夏季雖然屬于多雨季節(jié)但光照和溫度是全年最高的時期,H2藻株相對而言更適宜在較高溫度和光照條件下生長。

進一步對比溫度和光照資料(表 1),不難發(fā)現從4月到9月份,氣溫較高而日照時間長(降水天數少),為什么4～5月藻株H0生長較快,而6～8月份藻株H2生長較快？進一步分析降雨資料就可以看出,4～5月份陰天日數和降雨量相對都偏少,因此推測 4～5月份的光、溫數據值應該相對穩(wěn)定,不存在反復無常的巨大變化; 相反在 6～8月份陰天日數和降雨量都偏多,也就意味著光、溫數據值隨天氣變化時常呈現很大幅度變動,在晴天時極端高溫應更高、光線更強,相反在陰雨天溫度相應較低。從這點講 H2藻株比H0對不斷變化的高溫和高光強適應能力更強。

2.2 不同藻株累積蝦青素的年際變化

雨生紅球藻累積蝦青素的年際變化(圖1)結果表明,3株紅球藻都是能累積蝦青素的藻株,盡管不同月份季節(jié)藻株間蝦青素含量存在一定差別,但其變化趨勢卻存在普遍性的共同增加或減少。對比不同月份各藻株蝦青素含量可以發(fā)現,藻株 H0蝦青素含量出現較高的頻率最多(全年中有7個月),其次為H2藻株,其蝦青素含量最高有 3個月,而藻株 H3蝦青素含量最高的月份比較少(全年只有2個月)。

在藻株H0積累蝦青素含量最高的1～2月、4月、9月、11～12月,也是藻株H0相對生長較快的時期(表2),在藻株H2蝦青素積累量最高的7～8月和10月份,也是該藻細胞生長較快的季節(jié)(表 2),即細胞生長速率與蝦青素含量呈正相關,該吻合表明藻株細胞生長速率快慢主要決定著紅球藻生產蝦青素多少。而在 3月、5月,藻株 H3蝦青素含量最高但其細胞生長速率并不快,表明此期該株藻單位細胞內累積的蝦青素量最高。故可以認為藻細胞累積蝦青素能力是決定產量的另一關鍵因素,其重要性僅次于細胞生長速率。

圖1 不同藻株蝦青素質量濃度的年際變化Fig.1 Year-round changes of astaxanthin contents in 3 trains of H.pluvialis

2.3 藻株間及藻株不同發(fā)育階段對光適應的差異

不同藻株在不同發(fā)育階段對光的需求結果(表3)表明,紅球藻各藻株之間以及不同發(fā)育階段光合作用對光的需求量存在一定差異。其中,在游動階段(特別是 H2)的綠色游動細胞光合作用對光需求普遍較高,H0、H2和H3光飽和點分別為750、1000、750 μmol /(m2·s); 不動細胞階段綠色細胞時期,不同藻株光合作用對光需求減小,該階段藻株H0、H2和H3綠色不動細胞的光飽和點分別為750、750、500 μmol/(m2·s); 而不動細胞階段的紅色細胞 H0、H2和 H3對光需求相對最弱,其藻株的光飽和點分別為500、750、500 μmol /(m2·s)。因此,不同藻株光合作用對光的需求順序是 H2＞H0＞H3,同一藻株不同發(fā)育階段光合作用對光需求的順序：綠色游動細胞＞綠色不動細胞＞紅色不動細胞。

表3 實驗藻株不同發(fā)育階段的光飽和范圍Tab.3 Light saturation points for cells at different development stages in 3 strains of H.pluvialis

對比表1和3數據,不同藻株對光的需求與實際培養(yǎng)過程細胞生長的結果是一致的,藻株 H2光合作用可以在更高的光強下進行,因此相對而言在光線較強(或因云層不斷變換導致光照強度瞬間出現大幅度變化)、以及多陰雨的夏季生長較好(表2)。對藻株H0而言,光合作用需求光照相對適中,在全年大多數季節(jié)(春、秋和冬季)生長相對較快(表 2)。而藻株H3,由于光合作用對光需求比較弱,不適宜在自然強光下生長,生長速率在全年之中很少表現較快(表2),相反,過多的光能勢必產生系列危害(如強光下大量產生過量活性氧自由基和誘發(fā)膜脂過氧化發(fā)生等),為此藻株 H3細胞采取積累大量蝦青素的策略,消耗過剩光能、淬滅活性氧自由基,屏蔽性吸收光線保護細胞器,這可解釋為什么藻株 H3在某些月份(3月、5月)細胞生長速率雖不快,但產生的蝦青素卻最多(圖 1)。

2.4 紅球藻細胞轉化過程中的光化學特性與光能分配

紅球藻(以 H0為例)不同發(fā)育階段的連續(xù)熒光動力學 OJIP曲線如圖 2所示,從中可以看出,紅色不動細胞的暗適應后最大熒光強度Fm最高(圖2A-3),而綠色游動細胞的Fm最低(圖 2A-1),綠色不動細胞的Fm介于二者之間(圖2A-2)。因此,綠色游動細胞最大光化學效率＜綠色不動細胞＜紅色不動細胞,依次分別為0.666,0.716和0.768。從圖2B中還可以看出,相對于游動細胞而言,不動細胞特別是綠色不動細胞熒光曲線在2 ms時出現明顯上升(圖2B-2和圖2B-3),同樣在照光30 ms時綠色不動細胞曲線(圖2B-2)也存在明顯變化,上述熒光強度Vj或Vi差異均表明在紅球藻從游動細胞向不動細胞轉化過程中,其有活性反應中心 PSⅡ的關閉程度發(fā)生了很大變化。綠色游動細胞最大熒光出現的時間比不同細胞早,隨后在500 ms處呈現快速下降(圖2B),意味著在游動細胞中,捕獲能量經反應中心 PSⅡ轉化并進入電子傳遞鏈后的流通過程是非常順暢的。

圖2 藻株 H0不同發(fā)育階段細胞的連續(xù)熒光動力學 OJIP曲線Fig.2 The continuous fluorescence kinetic OJIP curves of different cells of H.pluvialis strain Ho

依 Biolyzer軟件對圖 2進行數據分析獲得光化學反應參數和能量分配模式(圖 3)。To時,單位反應中心 PSⅡ吸收的光能(ABS/RC)在不同類型紅球藻細胞中存在差異,即以綠色游動細胞最多(圖 3-1A),綠色不動細胞次之(圖 3-2A),而紅色不動細胞最少(圖3-3A)。就單位反應中心PSⅡ捕獲的用于還原QA的能量TR0/RC而言,在不同類型紅球藻中的趨勢同ABS/RC基本一致,差別相對不明顯(圖 3-1A,3-2A,3-3A),在反應中心以熱量形式耗散能量(DI0/RC)中綠色游動細胞＞綠色不動細胞＞紅色不動細胞。被反應中心捕獲然后用于電子傳遞能量參數也是綠色游動細胞＞綠色不動細胞＞紅色不動細胞。該結果可進一步說明表 2綠色細胞光合作用需要更多的光線,而紅色不同細胞光合作用對光線需求最低。

圖3 藻株H0不同發(fā)育階段細胞光化學反應參數和能量分配模式Fig.3 The photochemical parameters and their energy pipeline models of H.pluvialis strain H0 at different developmental stages

圖3結果還表明,不同類型細胞在單位面積被反應中心 PSⅡ捕獲能量(TR/ABS)存在一定差異(圖3-1B,3-2B,3-3B),最大光化學效率從綠色游動細胞轉化到綠色不動細胞,然后累積蝦青素的紅色不動細胞依次上升,分別為0.666,0.716和0.768。上述不同類型細胞的最大光化學效率并不存在巨大的差異,但是由于綠色游動細胞中有活性的反應中心PSⅡ很少,僅是紅色不動細胞的19%(圖3-1B,3-3B),大部分(約 91%)反應中心 PSⅡ失活; 在綠色不動細胞中也只有90%反應中心PSⅡ存在活性(圖3-2B)。因此To時單位面積捕獲的光能用 TR0/CS0和用于電子傳遞的能量(ET0/CS0)在綠色游動細胞中都非常少(圖3-1C)。同樣,相對于不動細胞而言,Tm時綠色游動細胞單位面積捕獲的光能(TR0/CSm)和用于電子傳遞的能量(ET0/CSm)也都非常少(圖3-1D)。

從光能以熱量消耗角度分析,無論單位光合中心 PSⅡ耗散的熱能(DI0/RC)還是散失熱能占吸收光能的比率(DI0/ABS),都是綠色游動細胞＞綠色不動細胞＞紅色不動細胞(圖3-A和3-B)。但是,當光能被光合中心 PSⅡ捕獲和轉化進入電子傳遞以后,綠色細胞單位面積以熱輻射形式散失的能量都小于不動細胞(圖3-C和3-D)。上述結果說明,綠色游動細胞過多熱量耗散發(fā)生在光量子到達光合反應中心 PSⅡ之前。

雨生紅球藻是一種單細胞淡水綠藻,在雨生紅球藻生長的過程中,如果遇到脅迫條件,如高光強、高溫、營養(yǎng)鹽(氮、磷)饑餓、鹽脅迫等,綠色游動細胞會轉化為不動細胞并積累大量蝦青素而變紅。這種形態(tài)轉變并伴隨有蝦青素積累有其重要生理生態(tài)意義,作者認為可從以下角度分析：

其一,按照 McCord和 Fridovich[11]提出的自由基傷害學說,在脅迫條件下,植物體內的自由基和產生自由基的物質含量增加,導致自由基的產生和清除系統(tǒng)之間的平衡被破壞。在大規(guī)模利用自然光培養(yǎng)過程中,日光強度通常達到2000 μmol /(m2·s)以上(在云南楚雄直射光強度一般在 2000～3000 μmol/(m2·s)超過細胞光和作用需要的光照強度數倍(表3),即使光線在本實驗過程中被屏蔽掉30%～55%相對于光合需求而言仍然過高,因此過多的光線不可避免地導致植物體內大量積累活性氧自由基。過量的自由基與質膜和生物大分子反應,導致脂質過氧化,蛋白質降解,DNA突變和鏈的斷裂以及蛋白質的損傷[12],從而對生物體造成傷害。Liu等[13]利用甲基紫精(MV)誘導產生 O2—,通過測定抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ASA-POD),以及分析丙二醛(MDA)含量變化窺測膜脂過氧化程度,比較了不同類型雨生紅球藻細胞內保護酶系統(tǒng)和蝦青素的抗氧化能力。確定雨生紅球藻有兩種抗氧化機制,一種是綠色游動細胞中的抗氧化酶,另一種是紅色細胞中的抗氧劑蝦青素。在其生活周期中,隨著細胞轉化由一種防御系統(tǒng)轉變?yōu)榱硪环N防御系統(tǒng)來抵御環(huán)境氧化脅迫。綠色游動細胞主要依靠保護酶系統(tǒng)來清除活性氧,而不動細胞主要依靠蝦青素發(fā)揮作用。蝦青素的抗氧化作用遠遠超過保護酶系統(tǒng)[13]。

其二,紅球藻蝦青素積累通常發(fā)生在脅迫條件下,這時產生過多的能量以蝦青素形式儲存起來,以備后用,而不是以熱形式釋放造成局部溫度過高,看來也是細胞一種非常經濟有效的適應策略。該結果從能量模型中分配給光合能量中可獲得印證,紅球藻不動細胞所捕獲和用于電子傳遞的能量以及最大光化學效率都比游動細胞高(圖3)。

另外,作者認為蝦青素累積在脂質小體中,包圍在細胞核周圍和葉綠體類囊體片層等重要細胞器外面,形成屏障過濾光線,可降低強光以及紫外線等對上述細胞結構和功能發(fā)生殺傷作用[14]。如果如此,紅色不動細胞散失熱能占吸收光能比率(DI0/ABS)和單位光合中心 PSⅡ耗散的熱能(DI0/RC)應最大。事實相反,DI0/ABS 和DI0/RC大小順序為綠色游動細胞＞綠色不動細胞＞紅色不動細胞(圖 3-A和圖 3-B),本結果看似沒有支持本假說,但進一步考慮到葉綠素熒光分析使用的光源為單色光,波長在 660 nm,蝦青素在此波長下并沒有任何吸收,因此目前還不能否定該假設,如果換以波長更短的紫色或藍色光進行實驗,結果就可能支持本假設。

3 結論

(1) 雨生紅球藻在不同發(fā)育階段光合作用對光需求最大的為綠色游動細胞階段,其次為綠色不動細胞,對光需求最小的為紅色不動細胞,且不同藻株間光合作用對光需求存在差異性,其中H2＞H0＞H3。

(2) 在云南地區(qū)規(guī)?；a中,建議秋末、冬、春和夏初季節(jié)選擇藻株 H0,而在夏季和秋初選用藻株 H2培養(yǎng)可獲得蝦青素含量更高的雨生紅球藻藻粉。

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