于源華，宋禹，何秀霞，王寶德，劉華，李金海，熊光明

(1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.長(zhǎng)春衛(wèi)爾賽生物藥業(yè)有限公司，長(zhǎng)春 130022)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，水資源甾體激素污染愈加嚴(yán)重，這不僅僅危害人類健康而且危及到所有動(dòng)物的生存和發(fā)展[1]。甾體激素在江水、河水、湖水及海水中都被檢出[2-3]。其含量超標(biāo)可能造成男性女性化，還將引起男性前列腺癌，女性乳腺癌等[4]。

另有美國(guó)Julio E.Cabrera學(xué)者[9]報(bào)道了3,17-羥基類固醇脫氫酶基因，其編碼的3,17-HSD能夠降解固醇類固醇激素，如果從中國(guó)領(lǐng)域內(nèi)篩選到相關(guān)的菌種并克隆出關(guān)鍵基因?qū)槲覀冎卫砣找鎳?yán)重的環(huán)境激素污染起到重要作用。

1 材料

海水樣品：采樣地點(diǎn)位于大連海港附近，疑為被城市甾體激素污染。

菌種：HB101(實(shí)驗(yàn)室保存)。

質(zhì)粒：pCR2.1-TOPO(Invitrogen購(gòu)買)。

試劑：LB培養(yǎng)基，SIN培養(yǎng)基，kannmycin(北京鼎國(guó))，雌二醇，睪丸酮，膽固醇(sigma)，3-HSD/CR兔抗體(本實(shí)驗(yàn)室制備)。

儀器：熒光酶標(biāo)儀(BioTek)，全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，日立CF-16RX高速冷凍離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)(日立U-2800)PCR儀(eppendorf)。

2 方法

2.1 環(huán)境中甾體激素降解菌的篩選

從大連海港8個(gè)不同地點(diǎn)取了8種水樣。將水樣至于50mL離心管中，4000rpm，離心10min。取靠近底部沉淀物的2mL水至于EP管中，取400uL在含有2.6%NaCl和1mM睪丸酮的SIN瓊脂糖培養(yǎng)基上涂布，27℃過夜培養(yǎng)。挑取8個(gè)平板的單菌落(每個(gè)平板5個(gè)單菌落)到50uLSIN培養(yǎng)基中并編號(hào)記錄，混勻后各取2uL分別在A(無(wú)睪丸酮)和B(含有1mM 睪丸酮)平板上點(diǎn)樣。27℃過夜培養(yǎng)。A、B平板為1:10稀釋的SIN瓊脂糖培養(yǎng)基，含2.6%NaCl。

2.2 H5-1菌株的培養(yǎng)

H5-1菌株在含2.6%NaCl的 LB培養(yǎng)基中，27℃，180rpm，恒溫?fù)u床里培養(yǎng)12h備用。接于新的含2.6%NaCl的LB培養(yǎng)基中，27℃，180rpm恒溫?fù)u床里擴(kuò)大培養(yǎng)5-6h備用。H5-1菌株在含 kan(30g/ml)2.6%NaCl的 LB 培養(yǎng)基，27℃，180rpm的恒溫?fù)u床里培養(yǎng)12h備用。

2.3 ELISA檢測(cè)3-HSD/CR

2.4 3，17-羥基類固醇脫氫酶(3，17-HSD)目的基因的克隆

根據(jù)GeneBank中報(bào)道的EF488080.1的3,17-HSD基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，以 H5-1染色體DNA為模板，上游引物 P3-17L:5'-CATATGACAAATCGTTTGCAG-3'，下游引物P3-17R:5'-GGATC CATCTATAGCCCCATG-3'得到765bp的3,17-HSD基因片段。將該片段與載體 PCR2.1-TOPO連接制得pTOPO-3,17-HSD并轉(zhuǎn)化到HB101感受態(tài)細(xì)胞中，通過Kan、Amp雙抗性篩選得到HB-17突變菌株。再通過電擊與 H5-1菌株雜交，抗性篩選出H5-1突變株。

2.5 ELISA檢測(cè)3，17-HSD

為了定量3,17-HSD，建立 ElISA檢測(cè)方法，抗 3,17-HSD兔抗體由本實(shí)驗(yàn)室按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備。將含3,17-HSD蛋白樣品包被在酶標(biāo)板上，蛋白含量定于 1mg/mL，封閉洗滌之后每孔加入200uL1:10000稀釋的3,17-HSD抗體，加入二抗染色終止。

圖1 篩選降解水中雌激素的細(xì)菌Fig.1 The bacteria of estrogen in screening degradated water

圖2 H5-1的顯微鏡下結(jié)構(gòu)觀察圖Fig.2 The structure graph under HS-1 microscope

圖3 不同溫度條件下甾體激素誘導(dǎo)H5-1表達(dá)3-HSD/CR蛋白Fig.3 The steroid hormone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different temperature

圖4 不同濃度的甾體激素誘導(dǎo)H5-1表達(dá)3-HSD/CR蛋白Fig.4 The steroed homone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different density

圖5 H5-1菌株對(duì)膽固醇的降解作用Fig.5 The degradation of cholesterol by strain

3 結(jié)果

3.1 菌株篩選

通過27℃過夜培養(yǎng)，所有的40接種單菌落在B平板上均能良好生長(zhǎng)，只有8個(gè)接種單菌落不能在A平板上生長(zhǎng)(圖1)。很明顯，這8個(gè)菌落在B平板上可以利用睪丸酮作為碳源生長(zhǎng)，而在同樣低營(yíng)養(yǎng)條件且不含睪丸酮的A平板上無(wú)法生長(zhǎng)。根據(jù)進(jìn)一步的篩選，(第3次接種于1：10稀釋的SIN瓊脂糖培養(yǎng)基，含2.6%NaCl，1mM睪丸酮)從這8單菌落中得到一個(gè)單菌落，這種菌具有與睪丸酮叢毛單胞菌相似的特性，命名為H5-1。

A、B均為1：10稀釋的SIN培養(yǎng)基且含2.6%NaCl，B中另含有1mM睪丸酮。

經(jīng)過革蘭氏染色后的 H5-1的顯微鏡下照片顯示為革蘭氏陰性菌(圖2)。

3.2 H5-1中3-HSD/CR活性

在不同濃度和不同溫度條件下H5-1被雌二醇，睪丸酮誘導(dǎo)均可以使3-HSD/CR不同程度大量表達(dá)，但被膽固醇誘導(dǎo)3-HSD/CR表達(dá)量卻沒有增加。而且H5-1最適誘導(dǎo)溫度為27℃至37℃，最適誘導(dǎo)濃度為0.3mM(圖3、4)。

3.3 H5-1對(duì)膽固醇的降解

為了確定H5-1的降解能力及H5-1是否對(duì)膽固醇有降解作用，我們將培養(yǎng)好的 H5-1菌液加入到已知膽固醇含量的測(cè)試液中，恒溫27℃，1h后檢測(cè)測(cè)試液中的膽固醇含量。

由加入 H5-1菌液前后測(cè)試液中的膽固醇濃度可知，27℃1h后，測(cè)試液中0.5mM的膽固醇80%以上被降解(圖5)。

3.4 3，17-HSD的基因克隆

圖6 3，17-HSD基因PCR電泳圖Fig.6 The electrophoretic graph of 3，17-HSD gene

此圖顯示了3條PCR擴(kuò)增條帶，分別是740bp、600bp、380bp。

4 討論

該基因的成功克隆，為本課題組進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)、酶活性測(cè)定研究及利用分子克隆技術(shù)將綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)通過同源重組整合進(jìn)H5-1染色體 DNA中，構(gòu)建出H5-1熒光變異菌株奠定了工作基礎(chǔ)。

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