李麗賢 綜述 林昶 趙立東 楊仕明 審校

最近研究認(rèn)為，Notch信號途徑調(diào)節(jié)的側(cè)抑制參與哺乳動物內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞定向分化為毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的過程及其嵌合體的形成[1]，在該信號途徑中，使用γ-分泌酶抑制劑后，Notch信號途徑中級聯(lián)反應(yīng)效應(yīng)被抑制，其下游轉(zhuǎn)錄因子Hes1和Hes5的表達(dá)減少，間接增加了Math1的表達(dá)，因而可能促進(jìn)內(nèi)耳毛細(xì)胞的發(fā)育。本文就Notch信號途徑參與毛細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制作一綜述，以期對耳蝸毛細(xì)胞再生機(jī)理有更深認(rèn)識。

1 Notch信號途徑

Notch信號途徑在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于果蠅、無脊椎動物和脊椎動物中，對細(xì)胞的分化、增殖和凋亡及機(jī)體的整個(gè)生長發(fā)育過程的調(diào)控等起著重要的作用[2]。隨著對內(nèi)耳感覺上皮發(fā)育分子機(jī)制研究的深入，目前認(rèn)為Notch信號途徑相關(guān)基因(Hes1和Hes5)在哺乳動物內(nèi)耳感覺上皮發(fā)育中可能具有重要的作用。

1.1Notch信號途經(jīng)的組成 Notch信號途經(jīng)是由Notch受體、配體(DSL蛋白/哺乳動物是Jagged蛋白)和CSL(一類DNA結(jié)合蛋白)等組成。Notch配體N端有一個(gè)結(jié)合Notch受體所必需的DSL基序。當(dāng)配體(如Delta)和相鄰細(xì)胞的Notch受體結(jié)合后，Notch受體被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞質(zhì)區(qū)ICN(intracellular domain of Notch)，進(jìn)入細(xì)胞核與CSL結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。CSL為轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物中名為CBF1，在果蠅中名為suppressor of hairless，在線蟲中名為Lag-1，簡稱為CSL。CSL能識別并結(jié)合特定的DNA序列(GTGGGAA)，這個(gè)序列位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動子上，ICN不存在時(shí)，CSL為轉(zhuǎn)錄抑制因子，當(dāng)結(jié)合ICN時(shí)，CSL能誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。Notch信號的靶基因多為堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子(basic helix-loop-helix，bHLH)，它們又調(diào)節(jié)其它與細(xì)胞分化直接相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。如哺乳動物中的HES(hairy/ enhancer of split)、果蠅中的E(spl)(enhancer of split)及非洲爪蟾中的XHey-1等。

1.2Notch信號途徑的激活 Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不需第二信使和蛋白激酶的參與，可直接接收鄰近細(xì)胞的信號并傳到細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，Notch信號途徑的活化主要采用“三步蛋白質(zhì)水解模式”，其中涉及到3個(gè)蛋白質(zhì)水解切割位點(diǎn)S1、S2和S3。全長新合成的Notch前體是胞內(nèi)非活化分子，需被蛋白質(zhì)水解切割后才具有活性。步驟如下：①分泌運(yùn)輸中，Notch前體首先被高爾基體內(nèi)的Furin蛋白酶進(jìn)行S1位點(diǎn)切割，形成的兩部分通過鈣依賴性非共價(jià)鍵結(jié)合形成的異二聚體, 成熟的Notch受體被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面[3]。②配體結(jié)合到Notch胞外區(qū)后，ADAM金屬蛋白酶家族的TACE/Kuz在受體的S2位點(diǎn)切割，釋放出胞外部分，留下膜黏連的胞內(nèi)部分( Notch—intraTM)。③在跨膜區(qū)S3位點(diǎn)被早老素( presenilin，PS) 依賴的γ-分泌酶進(jìn)行切割釋放可溶的Notch胞內(nèi)片段( Notch—intra)[4]?？扇艿腘otch-intra被轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與Su(H)CBF1(Suppressor of Hairless/C-promoter Binding Factor 1)結(jié)合，激活E(sp1)/HES(Enhancer of split/human En — hancer of Split)等靶基因的表達(dá)，E(sp1)/HES等表達(dá)產(chǎn)物與其相應(yīng)的分化效應(yīng)基因的啟動子特異性結(jié)合，阻遏相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響毛細(xì)胞的分化。參與調(diào)控Notch信號途徑的基因均從胚胎早期就開始表達(dá)，在胚胎發(fā)育中起重要作用。

1.3Notch信號傳導(dǎo)途徑與內(nèi)耳感覺上皮的分化 Notch信號途徑在很多不同的物種、不同組織的發(fā)育、細(xì)胞的分化過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來的研究表明，Notch信號傳導(dǎo)途徑與哺乳動物內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞定向分化形成毛細(xì)胞和支持細(xì)胞及嵌合體的調(diào)節(jié)有關(guān)[1]。

1.3.1哺乳動物內(nèi)耳感覺上皮的發(fā)育 哺乳動物內(nèi)耳Corti器主要有兩種細(xì)胞，即內(nèi)、外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞。毛細(xì)胞與毛細(xì)胞之間各自由支持細(xì)胞分隔開來，形成了獨(dú)特的嵌合體形式，毛細(xì)胞由底回至頂回、內(nèi)毛細(xì)胞至外毛細(xì)胞的順序逐漸發(fā)育成熟。目前證實(shí)[1]Notch信號通過調(diào)節(jié)側(cè)抑制(lateral inhibition)，即細(xì)胞表面Notch配體與相鄰細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，啟動信號途徑，防止其它細(xì)胞發(fā)生同樣的分化，這種調(diào)節(jié)在內(nèi)耳細(xì)胞定向分化及嵌合體形成中起關(guān)鍵作用。當(dāng)毛細(xì)胞損傷后，Notch信號通路的側(cè)抑制可能就削弱了，所以，有關(guān)支持細(xì)胞能轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的學(xué)說也許和側(cè)抑制的削弱有關(guān)，此待進(jìn)一步研究。在耳蝸發(fā)育過程中Notch配體的表達(dá)在math1表達(dá)后才開始表達(dá)，并在Notch信號途徑的側(cè)抑制中發(fā)揮著作用。Notch受體和配體Dll1(Delta-like1)和Jag2(Jagged2)在E14.5就開始在內(nèi)耳表達(dá)。而另一種配體Dll3(Delta-like3)在E15.5聽覺毛細(xì)胞發(fā)育階段與Dll1和Jag2共同表達(dá)且一直持續(xù)到出生一周后其表達(dá)才下調(diào)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Dll3缺陷的小鼠并不會導(dǎo)致毛細(xì)胞數(shù)量的增多[5]，而Notch配體Jag2或Dll1兩者同時(shí)缺失時(shí)毛細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)大量的增多[6]；但當(dāng)Jag2和Dll1單獨(dú)缺失時(shí)，毛細(xì)胞數(shù)量變化并不大[6,7]，由此推測兩者具有協(xié)同作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Dll3存在與否并不影響毛細(xì)胞數(shù)量的變化，只要Dll1或Jag2其中一者存在就能發(fā)揮Notch介導(dǎo)的側(cè)抑制作用，Dll1或Jag2對Dll3具有補(bǔ)償作用。另有實(shí)驗(yàn)證明Notch的另一配體Jag1，其基因的表達(dá)或敲除并不影響Notch信號介導(dǎo)的側(cè)抑制作用[8]。

1.3.2Notch信號下游效應(yīng)基因Hes1、Hes5與前神經(jīng)元基因math1對內(nèi)耳感覺上皮分化的影響 在哺乳動物內(nèi)耳感覺上皮中，Notch信號相關(guān)的靶基因家族主要是含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子bHLH基序的基因，在哺乳動物內(nèi)耳感覺上皮的定向分化，特別在毛細(xì)胞的形成中起關(guān)鍵作用，并參與側(cè)抑制的調(diào)控及嵌合體的形成，其中主要有Math1、Hes1、Hes5基因。 Math1是一個(gè)特定神經(jīng)堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，同果蠅的前神經(jīng)元基因atonal(ato)具有較高的同源性。1999年Bermingham等[9]首次報(bào)道Math1基因在內(nèi)耳感覺上皮中表達(dá),Math1基因缺陷小鼠胚胎不能產(chǎn)生耳蝸和前庭毛細(xì)胞，Math1過表達(dá)能使耳蝸的GER(大上皮嵴)細(xì)胞及橢圓囊的支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為額外的毛細(xì)胞[10]。在耳蝸發(fā)育階段，Math1最早表達(dá)于E12.5,而在E14和P0期間是毛細(xì)胞開始分化的重要階段，Math1首先表達(dá)，而后Hes1、Hes5才表達(dá)。Math1基因作為一種促毛細(xì)胞基因(pro-hair cell gene)在感覺細(xì)胞定向分化及毛細(xì)胞的形成中起關(guān)鍵作用[11]。Akazawa等[12，13]研究發(fā)現(xiàn)bHLH編碼的math1蛋白中間的E-box相關(guān)的轉(zhuǎn)錄通過bHLH的另一種蛋白E 47，而Hes1和Hes5可以和E47形成沒有功能的異二聚體來抑制E47的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步抑制Math1的作用。在ICR小鼠Jagged2基因突變體(Jag2△DSL)模型中發(fā)現(xiàn)了Hes5基因表達(dá)下降，因此，Notch可能通過Jag2激活Hes5基因表達(dá)，阻礙分化效應(yīng)基因Math1的表達(dá)[14]。Hes1和Hes5是Notch信號途徑下游效應(yīng)因子，參與了耳蝸的發(fā)育和調(diào)節(jié)毛細(xì)胞的分化[15]。在Hesl和Hes5基因突變的小鼠耳蝸中Math1的表達(dá)增加，提示Hes基因通過抑制Math1的表達(dá)來調(diào)節(jié)毛細(xì)胞的分化。Math1可以直接與Hes5結(jié)合，激活Hes5反過來抑制Math1自身的表達(dá)，這是Math1表達(dá)負(fù)性自身調(diào)節(jié)環(huán)路[16]。實(shí)驗(yàn)顯示Hes1過表達(dá)阻止Math1誘導(dǎo)的毛細(xì)胞分化,因此Hes1通過Math1對毛細(xì)胞分化產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用,這些結(jié)果提示Math1和負(fù)調(diào)節(jié)因子Hes1之間的平衡對于產(chǎn)生合適的內(nèi)耳毛細(xì)胞數(shù)目非常關(guān)鍵[17]。在耳蝸，Hes1基因突變后可引起內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)量增加，而Hes5突變可引起外毛細(xì)胞數(shù)量增加；在前庭器官，無論是Hes1還是Hes5缺失都會引起橢圓囊或球囊產(chǎn)生額外的毛細(xì)胞。這就說明了Hes1和Hes5在調(diào)節(jié)哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化作用上既獨(dú)立又有疊加[15]。

2 γ-分泌酶抑制劑促進(jìn)內(nèi)耳毛細(xì)胞再生

2.1γ-分泌酶的作用 γ-分泌酶在Notch受體的剪切并釋放可溶的Notch胞內(nèi)片段中起著關(guān)鍵的作用。有研究表明[18]，細(xì)胞表面的γ-分泌酶的蛋白水解作用是在細(xì)胞膜進(jìn)行的，可以裂解細(xì)胞間的粘附結(jié)構(gòu)并能釋放胞間的信號片段。因此，使用γ-分泌酶抑制劑后可以阻止Notch信號的活化，進(jìn)一步抑制了Hes1和Hes5的表達(dá)，從而以使Math1的表達(dá)增加[19]，這對內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生和修復(fù)可能起到重要的促進(jìn)作用。

2.2γ-分泌酶抑制劑在體外培養(yǎng)Corti器的研究 近年來的研究表明，在體外培養(yǎng)胚胎期或新生的小鼠[20，21]Corti器中加入γ-分泌酶抑制劑(MDL28170或DAPT)阻斷Notch信號通路后，能夠使耳蝸產(chǎn)生額外的毛細(xì)胞。Yamamoto等[21]為了證明 Notch信號通路在耳蝸的作用，分別在體外培養(yǎng)的胚胎時(shí)期和新生(P3)的ICR小鼠Corti器里加入γ-分泌酶抑制劑MDL28170三天后，在毛細(xì)胞旁邊的區(qū)域即Hensen細(xì)胞的位置出現(xiàn)了異位的MyosinVIIa陽性的細(xì)胞，且異位的MyosinVIIa陽性的細(xì)胞數(shù)比對照組明顯的增多。RT-PCR分析顯示：在MDL28170組Hes1和Hes5表達(dá)都有減少，其中Hes5減少明顯，而Math1表達(dá)則增加。Takebayashi等[20]用另一種γ-分泌酶抑制劑DAPT對小鼠胚胎的Corti器進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在E14.5時(shí)及其以后的胚胎期，DAPT才對Notch信號通路有抑制作用。RT-PCR檢測顯示Hes1和Hes5的表達(dá)減少，而Math1的表達(dá)增加，并且發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)胞數(shù)目的增多不是因?yàn)槊?xì)胞的增殖引起的，而是通過支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化來的。

2.3γ-分泌酶抑制劑在體的實(shí)驗(yàn)研究 2007年Hori等[22]發(fā)現(xiàn)正常成年豚鼠聽覺上皮幾乎不表達(dá)Notch1和Jagged1，而用耳毒性藥物造模后，發(fā)現(xiàn)損傷的聽覺上皮可以表達(dá)Notch1和Jagged1。從鼓階用微注泵持續(xù)給MDL28170，2周后可在聽覺上皮出現(xiàn)異位myosinVIIa陽性的細(xì)胞，表明γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號后，在成年哺乳動物聽覺上皮出現(xiàn)了異位的毛細(xì)胞，說明使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路對損傷的聽覺上皮的毛細(xì)胞再生可能有促進(jìn)作用。Notch1、Jagged1的表達(dá)和異位毛細(xì)胞的免疫表型主要在聽覺上皮的內(nèi)溝區(qū)，而胚胎和新生哺乳動物的聽覺上皮的大上皮嵴區(qū)和成熟動物的聽覺上皮內(nèi)溝區(qū)域相對應(yīng)[23]。

然而，體外培養(yǎng)和在體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路后，也會造成不良的副作用。Daudet等[24]研究發(fā)現(xiàn)在雞胚的HH16-17時(shí)期就開始持續(xù)用DAPT抑制Notch信號，可能會導(dǎo)致聽覺斑的數(shù)量、大小及毛細(xì)胞的減少。但是，相對于用病毒等載體攜帶Math1基因促進(jìn)毛細(xì)胞再生的研究來說，γ-分泌酸抑制劑可不用考慮病毒的毒性，有利于臨床的推廣應(yīng)用。所以，對于γ-分泌酶抑制劑，還需對其進(jìn)行更充分的實(shí)驗(yàn)研究，以便能應(yīng)用于內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的研究中。

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