楊曉林 綜述 許政敏 審校

新生兒先天性聽力損失是一種常見的出生缺陷。研究表明，新生兒聽力損失發(fā)生率為0.1%～0.3%，重癥監(jiān)護(hù)病房的新生兒聽力損失發(fā)生率可高達(dá)2%～4%[1]。據(jù)報(bào)道[2],超過50%的語(yǔ)前聾與遺傳因素有關(guān),在遺傳性聾中,約70%為非綜合征型聾(nonsyndromic hearing impairment, NSHI)， NSHI中屬于常染色體隱性遺傳的約占80%左右，常染色體顯性遺傳的約占15%～20%左右，而X連鎖遺傳以及線粒體遺傳則各占1%左右。 迄今為止，已有140多個(gè)基因位點(diǎn)被認(rèn)為與非綜合征型聾有密切關(guān)系(http://webh01.ua.ac.be/hhh/)，其中GJB2基因是目前已知的最主要的致聾基因，約占50%以上[3～5]。

1 GJB2基因的結(jié)構(gòu)和功能

編碼縫隙連接蛋白26(connexin 26，CX26)的GJB2基因是1993年被克隆出來的, 1997年首次被發(fā)現(xiàn)其與NSHI有密切關(guān)系,定位于常染色體13q11-12，DNA全長(zhǎng)為4 804 bp,由兩個(gè)外顯子組成[即一個(gè)簡(jiǎn)短的非編碼外顯子(exon1)和一個(gè)長(zhǎng)的蛋白編碼外顯子(exon2),編碼區(qū)主要存在于后者], 編碼區(qū)為678 bp。其啟動(dòng)子區(qū)域由7個(gè)GC盒(即GGGCGG或CCGCCC分別位于DNA序列的-1 229,-746, -379,-313,-151,-93及-81位點(diǎn))、兩個(gè)GT盒,一個(gè)TTAAAA盒(位于DNA序列的-24位點(diǎn))、一個(gè)NF-B結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)金屬反應(yīng)元件、一個(gè)乳腺因子結(jié)合位點(diǎn)及一個(gè)YY1樣結(jié)合位點(diǎn)共同組成[6]。其編碼的縫隙連接蛋白26以六聚體的形式在細(xì)胞縫隙連接處形成穿膜通道，這些通道是細(xì)胞間電解質(zhì)、第二信使和代謝物質(zhì)的重要通路，在信息傳遞和物質(zhì)交換中起重要作用[7]。在內(nèi)耳，GJB2基因主要表達(dá)在耳蝸的支持細(xì)胞、血管紋、基底細(xì)胞、螺旋隆凸、神經(jīng)感覺上皮和耳蝸傳導(dǎo)纖維[8～10]。目前認(rèn)為CX26在鉀離子從毛細(xì)胞到耳蝸內(nèi)淋巴的再循環(huán)中起重要的作用。當(dāng)毛細(xì)胞受到外界刺激后,鉀離子經(jīng)內(nèi)耳毛細(xì)胞循環(huán)回流進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴液,縫隙連接蛋白通道在此過程中具有調(diào)控作用。GJB2基因突變包括移碼突變、缺失、插入等，可產(chǎn)生有功能缺陷或無功能的Connexin26蛋白，在其蛋白翻譯及通道蛋白聚集水平產(chǎn)生影響。Paola等[11]應(yīng)用免疫熒光的方法(利用luciferyellow)研究Connexin26基因突變所產(chǎn)生的Connexin蛋白功能影響的過程中，發(fā)現(xiàn)部分突變可導(dǎo)致縫隙連接蛋白功能及Hela細(xì)胞連接功能的減退，影響細(xì)胞間的正常物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻礙了聲信號(hào)向神經(jīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)化。其影響至少存在于三個(gè)方面：①影響縫隙連接蛋白的聚集；②引起蛋白交通或標(biāo)靶的缺陷；③產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完整但功能缺失的連接蛋白。因此，GJB2基因突變可以引起Connexin26蛋白正常結(jié)構(gòu)的破壞，使上皮細(xì)胞間連接通道的完整性破壞以及通道開關(guān)的異常[11],使其傳遞信息的功能受阻或紊亂。而細(xì)胞外的離子濃度是毛細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ),由于連接通道的異常,使鉀離子回流進(jìn)入內(nèi)淋巴液的循環(huán)受到影響 ,濃度發(fā)生改變,導(dǎo)致Corti器鉀中毒,從而引起感音神經(jīng)性聾[12]。

2 GJB2基因突變的分子流行病學(xué)

近年來世界各國(guó)均對(duì)本國(guó)耳聾患者的GJB2基因進(jìn)行了大規(guī)模調(diào)查研究。匈牙利耳聾患者中GJB2基因突變占遺傳性隱性非綜合征型聾的46%[13]，德國(guó)患者中占17%[14]，美國(guó)患者中占24.3%[15]，黎巴嫩患者中占33%[16]，奧地利患者中占45.8%～71.4%[17,18]，中國(guó)患者中占21%[19,20]，巴西患者中占11.5%～22%[21]，伊朗患者中占16.7%[22]，巴勒斯坦患者中占11 %[23]，希臘患者中占42．2 %[24]，印度患者中占17.7%[25]，以色列患者中占39 %[26]。各國(guó)的研究情況進(jìn)一步說明，GJB2基因突變?cè)趯?dǎo)致遺傳性非綜合征型語(yǔ)前聾方面有著非常重要的意義，亟待開展對(duì)該基因的臨床檢測(cè)工作。

GJB2基因突變分為致病突變和多態(tài)性改變,致病突變是指人群中個(gè)體的 DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使基因的表達(dá)性狀和功能發(fā)生改變，在單基因遺傳病家系后代中，與遺傳性狀共同出現(xiàn)。多態(tài)性改變是指人群中個(gè)體的DNA 分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但基因的表達(dá)性狀及功能不改變,不與遺傳性狀共伴隨。截止2008年10月9日已有219種以上的突變方式報(bào)道(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，其中至少有111種突變明確可以引起NSHL(http://davinci.crg.es/deafness)，這給GJB2基因的分子診斷造成很大的困難,也是其臨床表現(xiàn)差異很大的一個(gè)重要原因。另外尚有一部分突變形式如109G-A等是否引起耳聾還存在爭(zhēng)議,需要進(jìn)一步的大樣本研究來證實(shí)。

GJB2基因的致病突變是遺傳性非綜合征型聾的主要致病原因，常見的突變熱點(diǎn)有35delG、235delC、33-35insG、167delT等。近年的研究發(fā)現(xiàn),這些突變熱點(diǎn)存在明顯的種族差異,比如:在地中海國(guó)家和美國(guó)遺傳性非綜合征型聾患者中35delG突變位點(diǎn)占總突變的60%～85%[27];猶太人中最常見的突變熱點(diǎn)為167delT,約占53%,而35delG突變只占18%;中國(guó)和日本中最常見的的突變熱點(diǎn)為235delC,分別占93%、73%[28,29],而35delG的發(fā)生頻率卻很低[30]。

GJB2常見的致病突變的分子學(xué)表現(xiàn)為：①35delG突變是其序列的第30～35位的6個(gè)G殘基中缺失一個(gè)G殘基，導(dǎo)致密碼子序列移位產(chǎn)生終止密碼子，使其翻譯過程提前中止于13號(hào)密碼子，形成含有12個(gè)氨基酸的小多肽而導(dǎo)致縫隙連接蛋白功能的異常[31]；②167delT是指編碼區(qū)167處的T缺失造成移碼突變，使終止密碼提前到82位，最終形成含有81個(gè)氨基酸的多肽[31]；③235delC是指在編碼區(qū)235處C缺失造成移碼突變，使終止密碼提前82位，最終形成含有81個(gè)氨基酸的多肽，比野生型蛋白的226個(gè)氨基酸截短了145個(gè)，且只有前 79個(gè) 氨基酸與野生型相同[32]。Connexin26蛋白分為5個(gè)區(qū)，即NT區(qū)、跨膜區(qū)(M1、M2、M3、M4)、細(xì)胞外區(qū)(E1、E2)、胞漿內(nèi)連接區(qū)(CL)和CT區(qū)。235delC突變型 Cx-26多肽的M2區(qū)部分缺失，CL、M3、E2和M4區(qū)完全缺失，產(chǎn)生無功能的縫隙連接蛋白。此突變型蛋白可能喪失對(duì)縫隙連接通道pH值的調(diào)控，降低縫隙連接的通透性，導(dǎo)致聽力下降。以上這幾種常見的突變形式均可以稱為截?cái)嗤蛔?此類基因所合成的Connexin26幾乎沒有功能,可以引起相對(duì)來說更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。另外還發(fā)現(xiàn)有許多突變位點(diǎn)只是其中某個(gè)核苷酸的置換,結(jié)果影響了其中一氨基酸的性質(zhì),并未使合成的肽鏈的長(zhǎng)度改變,使其所合成的Connexin26功能相對(duì)低下,此種形式可以稱之為非截?cái)嗤蛔儭?/p>

多態(tài)性改變屬于正?，F(xiàn)象，絕大部分基因的多態(tài)性改變?cè)?%左右。GJB2基因的多態(tài)性改變明顯增高,目前已報(bào)道的約有42種(http://davinci.crg. es/deafness)，如G79A、T101C、C384T等，多態(tài)性改變單獨(dú)出現(xiàn)均不引起疾病,但如此多無義突變的出現(xiàn)給GJB2基因的分子診斷帶來了很大的麻煩。

3 GJB2基因診斷方法的研究進(jìn)展

GJB2基因的編碼區(qū)只有679 bp,且集中在一個(gè)外顯子上，這使得對(duì)它的檢測(cè)相對(duì)方便,然而由于其突變的多樣性,突變位點(diǎn)的不確定性以及其在普通人群中比較低的發(fā)生率,目前尚難以形成一種經(jīng)濟(jì)、快速的方法進(jìn)行大范圍的篩查。傳統(tǒng)的方法主要包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、限制酶切指紋—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(restriction endonucleases fingerprinting— single strand conformation polymorphism REF—SS—CP)、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(poly— merase chain reaction—single strand conformation poly— morphism PCR—SSCP)、變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、變性高效液相色譜分析(denaturing high performance liquid chromatography，dHPLC)及直接測(cè)序(di—rectsequencing，DS)等[33～35]。其中比較適合于大樣本篩查的方法之一是變性高效液相色譜分析(dHPLC)，該方法主要原理是基于不同片段的Tm值的差異對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行篩查，依據(jù)其峰形的不同進(jìn)行初步篩查，對(duì)于有異常峰形的通過DNA測(cè)序進(jìn)行確定。對(duì)于GJB2這種突變形式多樣且片段短小集中的基因來說，此方法有很大的優(yōu)勢(shì) ，是目前比較快速的基因篩查方式之一[34，35]。另外,基因芯片技術(shù)是近幾年出現(xiàn)且不斷完善的基因檢測(cè)方法之一，針對(duì)GJB2在中國(guó)常見的幾種突變形式, 王國(guó)建等[36]利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè),證實(shí)了其具有快速、高通量、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn), 顯示出廣闊的臨床應(yīng)用前景，然其費(fèi)用高是其目前難以用于臨床的主要原因之一，積極開發(fā)和完善新的基因檢測(cè)芯片，使GJB2基因檢測(cè)進(jìn)入臨床，是廣大科研工作者面臨的一個(gè)重要任務(wù)。

4 GJB2突變患者基因型與臨床表型相關(guān)性研究現(xiàn)狀

大量的臨床研究顯示[37～41],由GJB2基因突變導(dǎo)致的遺傳性非綜合征型聾在兩側(cè)對(duì)稱性、始發(fā)年齡、聽力損失程度、穩(wěn)定性方面都具有多樣性。GJB2 相關(guān)性耳聾一般為雙耳同時(shí)受累,耳聾程度呈對(duì)稱性,少數(shù)表現(xiàn)為不對(duì)稱性,也有單耳受損報(bào)道;多數(shù)表現(xiàn)為出生即有的先天性聾,部分表現(xiàn)為嬰幼兒期或青少年始發(fā)的后天性聾,但多為語(yǔ)前聾;其聽力損失程度變異比較大，可由輕度到極重度，但多數(shù)為重度或極重度聾；聽力圖曲線主要為殘余型、斜坡型和平坦型，極少為U型，但沒有以低頻下降為主的上升型曲線。通過耳聲發(fā)射、聽性腦干反應(yīng)等電生理的研究提示，GJB2基因突變對(duì)耳蝸的損傷主要是在外毛細(xì)胞，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[42]。2006年Norris 等[43]報(bào)道了1994～2002年出生于亞利桑那州、愛達(dá)荷州、伊利諾州等州的9名有GJB2基因突變的患兒出生后均通過了新生兒聽力篩查，然而在出生后12～60個(gè)月時(shí)被確診為耳聾。2006年Waheeda[44]也報(bào)道了2例GJB2突變患者出現(xiàn)遲發(fā)性聽力損失[41]。這些研究表明，并非所有的GJB2基因突變患者在出生時(shí)即已發(fā)生聽力損失，在連接蛋白功能缺陷最終形成并對(duì)機(jī)體造成損害前,可能存在一個(gè)早期的窗口期,這對(duì)早期診斷帶來了困難，也給治療帶來了新的希望[37]。另外Tomohiro等[45,46]在大規(guī)模的研究中發(fā)現(xiàn)，患者的聽力學(xué)表現(xiàn)與發(fā)生在GJB2基因上的突變位點(diǎn)有很大的關(guān)系，截短突變(如235delC、35delG)比非截短突變(M34T、V37I、 L90P)引起的臨床癥狀重，純合的截短突變與一種截短突變合并一種非截短突變的復(fù)合雜合突變形式導(dǎo)致的臨床癥狀更為嚴(yán)重。隨著聽力學(xué)檢測(cè)技術(shù)和基因診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)于GJB2基因突變和臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系的研究會(huì)不斷深化。

5 結(jié)論和展望

近年來對(duì)GJB2基因及其與NSHI患者臨床表型相關(guān)性的研究已經(jīng)越來越深入,對(duì)GJB2基因的結(jié)構(gòu)、Gonnexin26的結(jié)構(gòu)和功能以及GJB2相關(guān)性耳聾患者臨床表現(xiàn)分型的研究都有了很大的進(jìn)展,確定的致病突變位點(diǎn)數(shù)在不斷上升,發(fā)現(xiàn)了越來越多的分型和新的特點(diǎn),這些研究成果為進(jìn)一步診斷和干預(yù)先天性耳聾提供了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。目前,對(duì)于GJB2基因型和表現(xiàn)型的研究還主要是在橫斷面水平進(jìn)行研究,對(duì)于早期的聽力學(xué)狀況以及動(dòng)態(tài)的縱向研究少,一方面是由于病例分散，難以進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤分析；另一方面在新生兒聽力篩查和基因診斷沒有廣泛開展之前,難以對(duì)此類患者做出早期診斷,以致不能對(duì)GJB2基因突變患者聽損傷的自然發(fā)病過程特別是早期的聽力學(xué)情況有更深入的認(rèn)識(shí)。 隨著GJB2基因診斷技術(shù)的不斷提高、全國(guó)新生兒聽力篩查工作的廣泛開展及對(duì)這一疾病的發(fā)生發(fā)展的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，有可能在更早的時(shí)間對(duì)此類疾病進(jìn)行診斷和干預(yù),為最終預(yù)防和治療打好基礎(chǔ)。如果在進(jìn)行新生兒聽力篩查的同時(shí)對(duì)GJB2基因進(jìn)行篩查并對(duì)攜帶有此基因突變的人群進(jìn)行前瞻性研究,以總結(jié)分析此類人群的聽力學(xué)特點(diǎn),進(jìn)而有可能依據(jù)表型推出基因型，制定出更適合此類人群的診斷標(biāo)準(zhǔn),以便能在疾病早期給于確診和干預(yù),最大限度的預(yù)防患者的聽力下降。王秋菊等[47]已經(jīng)在國(guó)內(nèi)開展了GJB2基因檢測(cè)在新生兒聽力篩查中小樣本的研究,但更大范圍和更大規(guī)模的研究還有待于進(jìn)一步的進(jìn)行。

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