譚少華,林耀波,李麗娟

(番禺區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 511400)

谷氨酸(Glutamate,Glu)是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的興奮性氨基酸,作為神經(jīng)遞質(zhì)之一參與體內(nèi)多種病理生理過程,在腦部缺血缺氧過程中,過多的谷氨酸產(chǎn)生的興奮毒性作用可能引起神經(jīng)元的凋死亡。一氧化氮(Nitric oxide,NO)作為一種血管舒張因子,不僅對心血管功能有調(diào)節(jié)作用,還起著神經(jīng)遞質(zhì)的作用[1],有報道發(fā)現(xiàn) NO參與了谷氨酸介導(dǎo)興奮毒性作用[2]。依達拉奉作為一種自由基清除劑,對缺血缺氧狀態(tài)下的神經(jīng)元的保護作用已得到眾多的研究證實。本研究旨在探討依達拉奉對谷氨酸毒性作用下誘導(dǎo)的神經(jīng)元釋放 NO的影響,進一步闡明依達拉奉保護神經(jīng)元的作用機制。

1 材料與方法

1.1 原代神經(jīng)元的培養(yǎng) 根據(jù)文獻方法并作出改良[3],將出生 24 h內(nèi)的 SD大鼠分離腦組織后,以一次性注射器(5 ml)針頭搗爛腦組織,注射器反復(fù)抽吸 3次,加入 0.125%胰酶(含 0.2‰EDTA)3 ml,置入 37℃水浴箱持續(xù)震蕩消化 3-5 min。細胞計數(shù)后調(diào)整細胞數(shù)目為 106/ml,接種于已用多聚賴氨酸鋪板的 6孔培養(yǎng)板上,24 h后換液,并加入阿糖胞苷 -C(終濃度為 10μM)抑制其他細胞生長。24 h后再次換液,終止阿糖胞苷 -C的作用。以后每 2-3 d換上述培養(yǎng)液 1次,培養(yǎng) 7 d后用于實驗。

1.2 神經(jīng)元純度鑒定 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 7 d后,神經(jīng)元特異烯醇化酶 (NSE)染色確定分離培養(yǎng)神經(jīng)元純度:PBS沖洗后加入一抗(兔抗大鼠 NSE:1∶200),4℃冰箱過夜,次日室溫下放置 30 min,加入二抗(山羊抗兔 IgG,1∶200),觀察 NSE陽性細胞率。

1.3 實驗分組 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 7 d后,實驗分為三組,空白對照組、Glu(50μM)組以及 Glu(50 μM)+Eda(100μM)組,分別在加入上述藥物處理前、6 h及 24 h后提取三組培養(yǎng)基作 NO濃度檢測。

1.4 NO的檢測 收集各組培養(yǎng)基后,采用硝酸還原酶法檢測。嚴格按照 NO試劑盒中的檢測步驟,在半自動生化分析儀(ZS/1S,北京中山生物公司)上檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用(x±s)表示;數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析,雙尾 t檢驗,以 P值 0.01或者 0.05作為統(tǒng)計學(xué)差異界限。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)神經(jīng)元的純度鑒定 NSE是神經(jīng)元特異性酶,NSE染色是用來鑒定神經(jīng)元的常用方法。本實驗分離的細胞 NSE染色后可見 95%以上的細胞呈梭形或橢圓形,細胞連接成網(wǎng)狀,細胞邊緣清晰,突起、胞膜及胞漿染色呈棕黃色,細胞核染色呈淡藍紫色,細胞有明顯的突起,提示其神經(jīng)元純度超過 95%,證實我們培養(yǎng)方法的可靠性。

2.2 谷氨酸對神經(jīng)元釋放 NO的影響 如表 1及圖 1所示,加藥前三組培養(yǎng)基的 NO濃度基本一致(P＞0.05),加入谷氨酸 6 h及 24 h后,培養(yǎng)基中的 NO濃度明顯升高(P＜0.01),提示谷氨酸能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)元釋放 NO。

圖1 各組不同時間 NO濃度的變化注:6 h三組間方差分析:F=21.739,P=0.000,與對照組比較,aP=0.000,bP=0.033,Glu組與 Glu+Eda組比較,c P=0.002;24 h三組間方差分析:F=38.366,P=0.000,與對照組比較,d P=0.000,eP=0.027,Glu組與 Glu+Eda組比較,f P=0.000。

表1 加藥前后各組培養(yǎng)液中 NO的濃度(x±s,n=10)

如表 1所見,各組培養(yǎng)基中 NO的濃度均隨時間推移有所上升,為進一步闡明 Glu誘導(dǎo)神經(jīng)元釋放 NO有無時間依賴性,分別將各組在三個不同時間點檢測的 NO濃度做自身對比(配對 T-test)。

2.3 各組自身加藥前后對照配對 T-test結(jié)果

如表 2所見,對照組在加藥 6 h、24 h NO濃度僅輕微上升,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),而Glu組、Glu+Eda組在加藥 6 h、24 h后兩個時間點均較加藥前有明顯的上升(P＜0.01);Glu組、Glu+Eda組加藥后 6 h與 24 h相比,NO濃度雖然都有輕微升高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),提示谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元釋放 NO無明顯時間依賴性,在 Glu作用6 h后,NO的釋放并無隨時間的延長有明顯進一步加強。

表2 各組自身加藥前后對照配對 T-test結(jié)果(n=10)

2.4 依達拉奉與谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元釋放 NO的關(guān)系 如表 1及圖 1所示,Glu組、Glu+Eda組加藥后 6 h后,NO濃度較對照組均顯著升高(P＜0.01),為對比加入依達拉奉后谷氨酸誘導(dǎo) NO釋放有無影響,經(jīng)單因素方差分析,Glu組 NO濃度較 Glu+Eda組升高更明顯(P＜0.01),提示依達拉奉能減少 Glu誘導(dǎo)神經(jīng)元釋放 NO。加藥后 24 h三組橫向比較的結(jié)果與加藥后 6 h的結(jié)果亦一致。

3 討 論

3.1 谷氨酸與 NO在神經(jīng)毒性作用中的相互關(guān)系 腦缺血預(yù)處理能引起一定程度的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Indusible nitric oxide synthase,iNOS)表達增加[4],而谷氨酸受體阻斷劑能阻斷腦缺血預(yù)處理所引起的 iNOS表達增加,間接提示谷氨酸能誘導(dǎo)NO釋放增加。谷氨酸注入大鼠側(cè)腦室內(nèi)可引起大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)陽性細胞增多[5],但缺乏直接證據(jù)證實谷氨酸能引起神經(jīng)元釋放 NO增加。本研究發(fā)現(xiàn),加入 Glu 6 h及 24 h后,培養(yǎng)基中的 NO濃度明顯升高(P＜0.01),提示 Glu能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)元釋放 NO。谷氨酸、NO作為神經(jīng)遞質(zhì)參與體內(nèi)眾多的病理生理過程。眾多研究表明,缺血缺氧時內(nèi)源性的谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用對誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡發(fā)揮著重要作用。然而,NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著雙刃劍的作用,一般認為病理生理過程中,早期釋放的 NO有保護作用,但后期過多的 NO則有神經(jīng)毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶抑制劑 AMDA(非對稱性二甲基精氨酸)能顯著地減弱谷氨酸對 PC12細胞的興奮毒性作用,其作用機制可能與抑制 NOS活性,減少 NO生成有關(guān)[6]。結(jié)合本研究提示,谷氨酸損傷神經(jīng)系統(tǒng)的作用途徑之一可能為通過引起神經(jīng)元釋放 NO增加。

3.2 依達拉奉與 NO的關(guān)系 在非神經(jīng)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn),依達拉奉能抑制經(jīng)細胞因子刺激的肝細胞 iNOS基因的表達[7],同時能延遲大鼠睪丸缺血再灌注后 NO釋放的峰值時間[8]。在神經(jīng)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn),NO能引起細胞凋亡,但依達拉奉能減弱 NO供體硝普鈉引起的星形膠質(zhì)細胞凋亡[9]。Noor等[10]在新生Wistar大鼠缺血缺氧模型的研究中發(fā)現(xiàn),依達拉奉可短暫地降低腦脊液內(nèi) NO的含量。上述研究提示在病理狀態(tài)下,依達拉奉可降低NO的釋放。

本研究發(fā)現(xiàn),雖然 Glu組及 Glu+Eda組加藥后6 h后 NO較對照組均有升高(P＜0.01),Glu組一氧化氮濃度較 Glu+Eda組升高更明顯(P＜0.01),提示依達拉奉能減少 Glu誘導(dǎo)神經(jīng)元釋放 NO。腦缺血再灌注后可產(chǎn)生大量自由基,自由基的生成除造成細胞膜性結(jié)構(gòu)受損外,還能引起谷氨酸等興奮性氨基酸釋放增加,而谷氨酸又可引起 NO釋放增加。NO性質(zhì)活躍,能迅速分解成自由基,如此惡性循環(huán)造成腦組織損傷。

綜上所述,依達拉奉作為一種自由基清除劑,在腦部缺血缺氧時的保護作用,一方面能減少自由基的堆積,另一方面還可抑制 NO的過量生成。

[1] Ignarro LJ.Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system:a historical overview[J].Journal of Physiology and Pharmacology,2002,53(4)∶503-514.

[2] Llansola M,Hernandez-Viadel M,Erceg S,et al.Increasing the Function of the Glutamate-Nitric Oxide-Cyclic Guanosine Monophosphate Pathway Increasesthe Ability To Learn a Y-Maze Task[J].Journal of Neuroscience Research,2009,87(10)∶2 351-2 355.

[3] 徐安定,譚澤鋒,譚少華,等.不同濃度外源性內(nèi)皮素 1刺激大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元增加釋放一氧化氮:首次國內(nèi)實驗直接證實[J].中國臨床康復(fù),2005,9(21)∶92-94.

[4] 馮榮芳,胡玉燕,李文斌,等.誘導(dǎo)型一氧化氮信號通路在代謝型谷氨酸受體 2/3介導(dǎo)的腦缺血耐受中的作用[J].中國病理生理雜志,2009,25(2)∶268-274.

[5] 盧 敏,王從榮,周厚綸.褪黑素對谷氨酸鈉致癇大鼠腦內(nèi)一氧化氮含量的影響[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,2009,18(1)∶53-58.

[6] 唐小卿,趙 靜,楊春濤,等.非對稱性二甲基精氨酸保護 PCI2細胞拮抗谷氨酸興奮性毒性的損傷作用[J].中國病理生理雜志,2009,25(2)∶248-253.

[7] Yoshida H,Kwon AH,Kaibori M,et al.Edaravone prevents NOS expression by inhibiting its promoter transactivation and mRNA stability in cytokine-stimulated hepatocytes[J].NITRIC OXIDEBIOLOGY AND CHEMISTRY,2008,18(2)∶105-112.

[8] Tamamura M,Saito M,Kinoshita Y,et al.Protective effect of edaravone,a free-radical scavenger,on ischaemia-reperfusion injury in the rat testis[J].BJU INTERNATIONAL,2010,105(6)∶870-876.

[9] Kawasaki T,Kitao T,Nakagawa K,et al.Nitric oxide-induced apoptosis in cultured rat astrocytes:Protection by edaravone,a radical scavenger[J].GLIA,2007,55(13)∶1 325-1 333.

[10]Noor JI,Ikeda T,Ueda Y,et al.A free radical scavenger,edaravone,inhibits lipid peroxidation and the production of nitric oxide in hypoxic-ischemic brain damage of neonatal rats[J].American J of Obstetrics and Gynecology,2005,193(5)∶1 703-1 708.