王 婧，胡夢(mèng)欣，應(yīng)苗苗，勵(lì)建榮,*

(1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院食品所，浙江 溫州 325006)

酶法制備小黃魚下腳料調(diào)味料的風(fēng)味前體物質(zhì)

王 婧1，胡夢(mèng)欣1，應(yīng)苗苗2，勵(lì)建榮1,*

(1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院食品所，浙江 溫州 325006)

以小黃魚下腳料為原料，利用酶解技術(shù)獲得小黃魚下腳料風(fēng)味前體物質(zhì)，通過(guò)單因素及響應(yīng)面分析，確定堿性蛋白酶(Alcalase)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)同步酶解工藝，研究料水比、酶解時(shí)間、酶用量、初始pH值和酶解溫度對(duì)酶解液水解度和感官品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，優(yōu)化的酶解工藝條件為料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6.5h、初始pH8.0、Alcalase用量2.5%、Flavourzyme用量3.0%。在此酶解條件下的水解度為40.11%，所得酶解液中氨基酸含量86.383g/100g，其中必需氨基酸32.785g/100g，鮮味和甘味氨基酸38.384g/100g，與酶解前相比氨基酸含量明顯增加，氨基酸總量增加了67.56%，其中必需氨基酸增加了82.02%，呈味氨基酸增加了79.52%，產(chǎn)品具有濃郁的小黃魚魚香味。

小黃魚下腳料；酶解；響應(yīng)面分析；水解度

近年來(lái)，世界漁業(yè)產(chǎn)量幾乎停滯不前。漁業(yè)資源曾經(jīng)被認(rèn)為是取之不盡、用之不竭的，導(dǎo)致大量漁業(yè)廢棄物的丟棄，每年丟棄的廢棄物大約20萬(wàn)噸(占總產(chǎn)量的25%)[1]，尤其像小黃魚等低值魚類其下腳料占魚體總量的40%左右，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。盡管一些魚類下腳料被用來(lái)加工魚粉等產(chǎn)品，但是仍處于低水平重復(fù)利用狀態(tài)，造成大量營(yíng)養(yǎng)成分(肽、氨基酸等)丟失[2]。因此，低值魚下腳料的增值開(kāi)發(fā)利用顯得愈發(fā)重要。

酶解技術(shù)屬先進(jìn)的風(fēng)味提取技術(shù)，利用酶解技術(shù)制備小黃魚下腳料酶解液，不僅最大程度地保留了魚鮮味，而且還得到許多小肽、氨基酸等易于被人體吸收的營(yíng)養(yǎng)成分和多種風(fēng)味前體物質(zhì)[3-4]。因此，以酶解液為基料，結(jié)合熱反應(yīng)技術(shù)，配以調(diào)味輔料，制備風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、品種多樣的天然調(diào)味料，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

本研究以小黃魚下腳料為原料，運(yùn)用響應(yīng)面分析法，采用Alcalase和Flavourzyme同步酶解技術(shù)，優(yōu)化小黃魚下腳料中風(fēng)味前體物質(zhì)制備工藝，獲得富含氨基酸、多肽的小黃魚下腳料酶解液。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃魚下腳料(頭、內(nèi)臟) 瑞安市華忠水產(chǎn)食品有限公司；甲醛(分析純) 上海申翔化學(xué)試劑有限公司；Alcalase(食品級(jí))、Flavourzyme(食品級(jí)) 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；Kjeltec 2300凱式定氮儀 福斯分析公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；07HWS-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 杭州通用電子儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 酶解原料制備

小黃魚下腳料→解凍→勻漿→冷凍干燥→超微粉碎→真空包裝(備用)

1.3.2 酶解工藝路線[5]

原料→加水勻漿→一定溫度、pH值條件下，加酶反應(yīng)一定時(shí)間→85℃滅酶20min→冷卻→離心(9000r/ min，20min)→傾出酶解液，備用

1.3.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)的測(cè)定

上清液氨基態(tài)氮通過(guò)甲醛電位滴定法[6]測(cè)定，總氮通過(guò)凱式定氮法測(cè)定。

1.3.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Bohnken中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)影響小黃魚下腳料水解度的4個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件及SAS程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的初步選擇

本研究分別選用Trypsin、Pepsin、Papain、 Flavourzyme、Protamex、Alcalase對(duì)小黃魚下腳料進(jìn)行酶解，在參考所選酶的最適酶解條件及預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料水比為1:5(g/mL)、酶用量(酶與底物質(zhì)量比)2%、酶解時(shí)間3h、pH7.0、酶解溫度55℃條件下，比較各蛋白酶對(duì)小黃魚下腳料水解度和感官評(píng)價(jià)的影響。其中，Pepsin酶解pH2.5、酶解溫度40℃[7]。

如表1所示，在同樣的酶解時(shí)間下，Alcalase水解度較高，效果較好。從酶解液風(fēng)味來(lái)說(shuō)，Papain風(fēng)味最差，有木瓜和魚腥混合的異味，Trypsin和Pepsin酶解液腥味較大，F(xiàn)lavourzyme酶解液風(fēng)味最好。單酶酶解時(shí)可采用Alcalase或Flavourzyme。Alcalase是一種內(nèi)切絲氨酸蛋白酶，在海洋性生物資源利用(尤其是酶解魚類蛋白)上具有顯著的優(yōu)越性[8]；而Flavourzyme是外切蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶的混合物，可用于脫除酶解液的苦味，改善和增進(jìn)酶解液的風(fēng)味[9]。

表1 幾種蛋白酶對(duì)小黃魚下腳料的酶解效果Table1 Comparison of single enzyme hydrolysis of small yellow croaker scraps with different proteases

2.2 Alcalase和Flavourzyme單因素試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步考察酶對(duì)蛋白質(zhì)水解結(jié)果的影響，采用單因素試驗(yàn)分別對(duì)兩種酶的酶解條件進(jìn)行分析，包括料水比、酶解時(shí)間、酶用量、酶解pH值和酶解溫度。結(jié)果表明，Alcalase最適酶解條件為料水比1:7(g/mL)、酶解時(shí)間4h、酶用量2.5%、初始pH9.0和酶解溫度55℃。采用相同的料水比1:7(g/mL)，F(xiàn)lavourzyme對(duì)蛋白質(zhì)的最適酶解條件為酶解時(shí)間2.5h，酶用量2.0%，初始pH7.5，酶解溫度55℃。

2.3 酶種類和加入順序的優(yōu)化[6,10-11]

固定料水比為1:7(g/mL)時(shí)，Alcalase和Flavourzyme在最適酶解條件下，分別對(duì)兩種酶的加入方式進(jìn)行比較研究，如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于Flavourzyme，Alcalase對(duì)蛋白質(zhì)的水解度更高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以內(nèi)切蛋白酶Alcalase啟動(dòng)水解，可給外切-內(nèi)切蛋白酶混合物Flavourzyme提供更多的作用位點(diǎn)[12]；而另一方面，F(xiàn)lavourzyme的加入能進(jìn)一步改善酶解液的風(fēng)味[13]。因此，實(shí)驗(yàn)還比較了兩種酶同時(shí)加入或先后加入的方式對(duì)蛋白質(zhì)酶解結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)兩種酶同時(shí)加入或先加入Alcalase后加入Flavourzyme的方式的酶解效果均較好，水解度最高達(dá)35.04%。綜合考慮到水解度、酶解液風(fēng)味及酶解工藝等因素，選擇Alcalase和Flavourzyme同步酶解為最適酶解條件。運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，得到P＜0.05，如表2所示，證明各因素間有顯著性差異。

圖1 酶解方式對(duì)小黃魚下腳料酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis mode on the DH of small yellow croaker scraps

表2 各因素影響的方差分析結(jié)果Table2 Variance analysis for the DH of small yellow croaker scraps with different hydrolysis modes

2.4 同步酶解時(shí)間的確定

圖2 同步酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of one-step double enzymatic hydrolysis duration on the DH of small yellow croaker scraps

在料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、初始pH7.5、Alcalase添加量2.5%、Flavourzyme添加量2%條件下，分別酶解2、3、4、5、6、7、8 h，測(cè)樣品的水解度，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間在2～6h時(shí)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，水解度顯著增加，6h以后，趨于平衡，水解度略有下降。這一方面可能是隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，體系pH值發(fā)生改變，底物濃度降低，造成酶活力的逐漸下降；另一方面可能是酶解產(chǎn)物的反饋抑制作用所致[14]。隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的蛋白質(zhì)不斷降解為易于人體吸收的小分子肽和氨基酸。酶解到一定程度，酶解液會(huì)出現(xiàn)苦味物質(zhì)，這與酶解過(guò)程中產(chǎn)生的疏水性氨基酸有關(guān)[15]。綜合考慮經(jīng)濟(jì)和風(fēng)味因素，選定6h為最適反應(yīng)時(shí)間。

2.5 同步酶解初始pH值的選擇

酶解pH值對(duì)酶催化反應(yīng)的影響包括兩個(gè)方面，一是影響酶的穩(wěn)定性，二則影響酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。酶解初始pH值過(guò)高或過(guò)低，均會(huì)影響酶的作用效果。結(jié)合兩種酶的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定5個(gè)不同水平(初始pH5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)考察不同初始pH值對(duì)同步酶解效果的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，初始pH值在5.5～8.5范圍內(nèi)上升，水解度不斷增加；當(dāng)pH值大于8.5時(shí)，水解度下降，由此可知，同步酶解的最適作用初始pH值為8.5。

圖3 復(fù)同步酶解初始pH對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of initial pH on the DH of small yellow croaker scraps

2.6 采用響應(yīng)面法優(yōu)化小黃魚下腳料的同步酶解工藝

2.6.1 分析因素的選取及分析方案[16]

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[17]，綜合2.2節(jié)Alcalase和Flavourzyme單因素試驗(yàn)結(jié)果，兩種酶的料水比與酶解溫度相同，故這里選取小黃魚下腳料樣品的酶解時(shí)間、酶解初始pH值、Alcalase用量、Flavourzyme用量4個(gè)因素為自變量，水解度為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3、4所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table3 Factors and levels in the response surface design

表4 響應(yīng)面分析結(jié)果Table4 Response surface design matrix and experimental results

2.6.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用SAS-RSREG程序?qū)憫?yīng)值和各因素進(jìn)行多元回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)回歸方程：DH/%＝35.53－1.51A＋0.23B－0.14C－1.60D－1.37AB－0.27AC－0.14AD＋0.15BC－1.10BD－0.27CD－1.49A2－0.66B2－0.80C2－1.07D2

回歸方程是模擬4個(gè)因素與水解度之間的關(guān)系，對(duì)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表及方差分析，可知模型對(duì)試驗(yàn)擬合良好，模型的P=0.0463＜0.05，表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。失擬項(xiàng)P=0.1421＞0.05，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度較好，此方法可靠，故可用回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[18]。將回歸方程的各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A、D、A2因素顯著(P＜0.05)，說(shuō)明響應(yīng)值的變化比較復(fù)雜，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.6.3 響應(yīng)面分析圖

響應(yīng)面分析的圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，它直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。如圖4所示，酶解時(shí)間和兩酶的交互作用，初始pH值和Alcalase的相互作用，Alcalase和 Flavourzyme的交互作用都比較顯著。而初始pH值與Flavourzyme用量、酶解時(shí)間的交互作用不顯著。在酶用量一定的條件下，水解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間反而使水解度略有下降。這與2.4節(jié)結(jié)果相符。

圖4 各因素間的相關(guān)性對(duì)水解度的影響Fig.4 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four hydrolysis conditions on the DH of small yellow croaker scraps

2.6.4 最佳酶解條件

通過(guò)SAS-RSREG程序嶺脊分析得到小黃魚下腳料的的最佳酶解條件，即料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6.59h、初始pH7.99、Alcalase用量2.38%、Flavourzyme用量2.93%。在此最優(yōu)工藝條件下水解度的理論值為37.19%。考慮到實(shí)際操作，將小黃魚下腳料的酶解工藝修正為料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6.5h、初始pH8.0、Alcalase用量2.5%、Flavourzyme用量3%。為檢驗(yàn)RSM法的可靠性，在此條件下做3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得小黃魚下腳料水解度為40.11%，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明該回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)小黃魚下腳料酶解效果的影響情況。

2.7 小黃魚下腳料酶解前后的氨基酸成分分析比較

表5 酶解前后體系的游離氨基酸變化Table5 Change in free amino acid composition of small yellow croaker scraps before and after the optimized hydrolysis

酶解小黃魚下腳料后，酶解液中富含豐富的游離氨基酸(表5)。其中，必需氨基酸含量(32.785g/100g)占氨基酸總量(86.383g/100g)的37.95%；呈鮮味特征性氨基酸天門冬氨酸(8.006g/100g)和谷氨酸(16.555g/100g)，呈甘味特征性氨基酸丙氨酸(6.380g/100g)和甘氨酸(7.443g/100g)，這4種呈味氨基酸[19]占氨基酸總量的44.43%；苦味氨基酸[14,20]亮氨酸(8.344g/100g)、組氨酸(1.724g/100g)、異亮氨酸(3.634g/100g)、纈氨酸(4.252g/100g)、甲硫氨酸(2.628g/100g)、精氨酸(0.564g/100g)和苯丙氨酸(3.778g/100g)占氨基酸總量的28.85%。與酶解前小黃魚下腳料中的氨基酸含量相比，氨基酸總量增加了67.56%，必需氨基酸含量增加了82.02%，天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸這4種呈味氨基酸增加了79.52%。值得注意的是，小黃魚下腳料經(jīng)酶解后，其苦味氨基酸的含量由32.09%略降至28.85%。因此，小黃魚下腳料的酶解液營(yíng)養(yǎng)豐富，具有濃郁的鮮香味，苦味較小，是較為理想的水產(chǎn)調(diào)味料基料。

3 結(jié) 論

通過(guò)酶的篩選實(shí)驗(yàn)，初步選定了對(duì)小黃魚下腳料酶解效果較好的堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶作為水解酶。進(jìn)一步通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析確定了A l c a l a s e和Flavourzyme同步酶解的最優(yōu)條件：料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6.5h、初始pH8.0、堿性蛋白酶用量2.5%、風(fēng)味蛋白酶用量3.0%。在此條件下，水解度達(dá)到40.11%。該值比響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值37.19%高一些，說(shuō)明響應(yīng)面模型可優(yōu)化酶解工藝條件。酶解液鮮味明顯，略有苦味，氨基酸含量為86.383g/100g，其中必需氨基酸含量為32.785g/100g，可作為良好的水產(chǎn)調(diào)味料反應(yīng)基料。酶解液的苦味可通過(guò)水產(chǎn)調(diào)味料的后續(xù)加工過(guò)程，如酸調(diào)、熱反應(yīng)等方法去除，相關(guān)工作正在開(kāi)展。

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Enzymatic Hydrolysis of Small Yellow Croaker Scraps for Preparing Flavor Precursors

WANG Jing1，HU Meng-xin1，YING Miao-miao2，LI Jian-rong1,*
(1. Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China；2. Food Research Institute, Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China)

Small yellow croaker scraps were enzymatically hydrolyzed to obtain flavor precursors. The simultaneous use of alcalase and flavourzyme was found to be the best choice for the production of flavor precursors with higher degree of hydrolysis (DH), and the hydrolysis conditions including material/liquid ratio, hydrolysis duration, enzyme dosage, initial pH and hydrolysis temperature were optimized by single factor method and response surface methodology based on Box-Benhnken experimental design. The optimized values of the four hydrolysis conditions were determined as follows: material/liquid ratio, 1:7; hydrolysis temperature, 55 ℃; initial pH, 8.0; alcalase dosage, 2.5%; and ourzyme dosage, 3.0%. Under these conditions, the DH was 40.11%, and the contents of total amino acids, essential amino acids and four delicious amino acids in the obtained hydrolysate were 86.383, 32.785 g/100 g and 38.384 g/100 g, increasing by 67.56 %, 82.02 % and 79.52% in comparison with those of the start material, respectively. Moreover, the obtained hydrolysate had a strong flavor of small yellow croaker.

small yellow croaker scraps；enzymolysis；response surface methodology；degree of hydrolysis

TS254.9；TS264.9

A

1002-6630(2010)20-0037-06

2010-01-09

浙江省溫州市海洋與漁業(yè)局項(xiàng)目

王婧(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc制造。E-mail：751285696@qq.com

*通信作者：勵(lì)建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn