謝麗源，張 勇*，鄧科君，彭衛(wèi)紅，甘炳成，李洪軍

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學研究院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.西南大學食品科學學院，重慶 400716；3.電子科技大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610054)

基于rDNA ITS序列分析的桑黃真菌菌株分子鑒定

謝麗源1,2，張 勇3,*，鄧科君3，彭衛(wèi)紅1，甘炳成1，李洪軍2

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學研究院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.西南大學食品科學學院，重慶 400716；3.電子科技大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610054)

對6份桑黃真菌菌株的rDNA ITS區(qū)段進行克隆測序和序列特征比較分析，并與GenBank中獲得的桑黃基源物種相關(guān)序列進行同源性比對，進一步將從GenBank檢索獲得的桑黃基源物種的ITS序列、復(fù)合外組ITS序列連同6份桑黃菌ITS序列一起作系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明：Sh-03、04、05、06與Phellinus linteus親緣關(guān)系最近，Sh-01與Phellinus baumii親緣關(guān)系最近，Sh-02與Phellinus baumii、Phellinus linteus、Phellinus igniarius的親緣關(guān)系相差甚遠，為一錯誤菌種。本實驗的研究結(jié)果可以提供一種準確可靠且簡單易行的桑黃真菌分子鑒定技術(shù)。

桑黃；Phellinus baumii；Phellinus linteus；Phellinus igniarius；rDNA ITS；分子鑒定

桑黃是擔子菌亞門(Basidiomy cota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的藥用真菌[1]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增強免疫等藥理活性[2-5]，尤其是顯著的抗腫瘤活性，近年來成為研究和開發(fā)的熱點。桑黃來源于菌物的子實體，在真菌傳統(tǒng)形態(tài)學分類中，菌物本身形態(tài)鑒定有一定的困難，而且受主觀因素影響較大，使得在研究及應(yīng)用中，出現(xiàn)“同物異名”、“同名異物”的現(xiàn)象，有些菌種保藏及生產(chǎn)單位并未對其研究材料作準確的鑒定，隨意給出種名，甚至沒有種名。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，位于18S rDNA及28S rDNA間的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析技術(shù)由于進化速率快、穩(wěn)定性好和測序方便，已廣泛的運用到多種真菌種屬水平的分類鑒定研究中[6-11]。因此，本實驗采用rDNA ITS技術(shù)對6份不同來源的桑黃

真菌進行分子鑒定，對更好地認識和利用桑黃真菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

6份桑黃真菌收集自我國各桑黃真菌保藏單位，憑證標本保存于四川省農(nóng)業(yè)科學研究院微生物研究中心，具體信息詳見表1。此外，檢索GenBank中登錄的3種桑黃真菌基源物種(P. baumii、P. linteus、P. igniarius) rDNA ITS序列(去除過短、污染及低質(zhì)量序列)，下載保存，用于序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析。

pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶 大連Takara公司；引物合成及序列測定由上海Invitrogen公司完成；其他常規(guī)試劑購于上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

BioSpec-mini分光光度儀 日本Shimadzu公司；I-Cycler熱循環(huán)儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

表1 桑黃真菌測試菌株Table 1 The strains used for Sanghuang fungi test

1.2 菌絲體培養(yǎng)

從在PDA平板上培養(yǎng)3d的菌落邊緣取2mm×2mm的菌絲塊，接種于100mL PDA液體培養(yǎng)基接種到100mL將菌種活化后接種于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃淺層靜置培養(yǎng)10d，收集菌絲，無菌水漂洗兩次，滅菌濾紙吸干水分，－8 0℃保存。

1.3 基因組DNA提取

取0.2～0.5g菌絲體用于基因組DNA提取，參考Murray等[12]的報道并稍作修改：1)液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)入2mL離心管中，每管加500μL預(yù)熱DNA提取緩沖液(1g/100mL CTAB、1.4mol/L NaCl、80mmol/L Tris-HCl pH8.0、20mmol/L EDTA pH8.0)，65℃保溫30min，期間搖動2～3次；2)加500μL氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)，振蕩混勻，10000r/min離心10min；3)取上清，加2×體積預(yù)冷無水乙醇，－20℃靜置60min，10000r/min離心10min；4)沉淀用75%的乙醇洗滌兩次，室溫風干；5)沉淀溶于200μL TE(pH 7.6)，RNase(DNase-free)至200mg/L，37℃處理60min；6)加200μL酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1，V/V)，振蕩混勻，10000r/min離心10min；7)取上清，加200μL氯仿∶異戊醇(24∶1，V/V)，10000r/min離心10min；8)取上清，加1/10體積3mol/L N aAc、2×體積預(yù)冷無水乙醇，混勻，－20℃靜置60min，10000r/min離心10min；9)75%乙醇洗滌兩次，室溫風干，溶于50μL滅菌雙蒸水。DNA純度、以0.8%瓊脂糖凝膠和BioSpec-mini分光光度儀檢測，將基因組DNA稀釋至100ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 rDNA ITS擴增及檢測

參照White等[6]報道的ITS通用引物ITS4、ITS5及GenBank中登錄的Phellinus屬真菌rDNA ITS序列，設(shè)計ITS-PF(5＇-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3＇)、ITSPR(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)引物對，由Invitrogen公司進行合成。25μL擴增體系包括：1×PCR buffer、1.5mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTPs、0.5 μmol/L上下游引物、50ng基因組模板DNA以及0.5U Taq DNA聚合酶。以I-Cycler熱循環(huán)儀進行擴增，PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸50s、32個循環(huán)；72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物中加入6×loading buffer 5μL混勻，于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離，EB染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄結(jié)果。

1.5 rDNA ITS序列的克隆和測序

目標產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上分離，以PCR純化試劑盒進行回收?；厥债a(chǎn)物連接入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。每個樣品均隨機挑選5個陽性克隆，委托Invitrogen公司進行雙向序列測定，序列信息登錄GenBank注冊。

1.6 序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

以Guglielmo等[13]公布的Phellinus屬真菌rDNA ITS序列為參照，對桑黃真菌rDNA ITS序列進行界定，除去5＇端18S rDNA及3＇端28S rDNA序列，保留ITS1-5.8S-ITS2序列。以Clustal W 1.8[14]進行序列兩兩比對及多序列比對(PAM250評分矩陣、空位罰分設(shè)為默認值)，比對結(jié)果進行人工修正。用MEGA 4.1[15]進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹構(gòu)建，以Kimura 2-parameter模型計算遺傳距離，所有對位排列結(jié)果中的空位或缺失數(shù)據(jù)作完全刪除處理。以P. tuberculosus(AM269806)、P. tremulae(AM269804)、P. spiculosus(AY558648)、Hydnochaete duportii(DQ404386)、Trametes versicolor (AY309018)、Ganoderma lucidum(FJ940919)為復(fù)合外組，用NJ法(neighbor-joining method)構(gòu)建分子進化樹，進行1000次自展抽值檢驗分子進化樹可靠性。

2 結(jié)果與分析

以桑黃液體靜置培養(yǎng)菌絲體為出發(fā)材料，采用改進的CTAB法進行基因組DNA提取，所得DNA溶液紫外吸收OD260nm/OD280nm比值在1.8左右，表明無RNA、蛋白質(zhì)干擾，純度較高，菌絲體DNA得率為10～20μg/g。瓊脂糖電泳結(jié)果表明，基因組DNA主帶清晰，DNA片段大小在30kb以上，無拖尾、降解現(xiàn)象，樣品間均勻一致(圖1)。這說明采用該法提取桑黃基因組DNA質(zhì)量好、產(chǎn)量高，完全能滿足后續(xù)PCR擴增對樣品基因組DNA質(zhì)量的要求。

圖1 桑黃樣品基因組DNA提取電泳檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis analysis of genomic DNA isolated from Sanghuang

圖2 桑黃樣品rDNA ITS序列擴增電泳檢測結(jié)果Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR amplified products using Sanghang rDNA ITS sequences

以桑黃菌絲體基因組DNA為模板，ITS-PF/ITS-PR為引物，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳分析，檢測到特異性擴增片段，其中Sh-02擴增片段相對較短(約630bp)，其余5個測試樣品擴增產(chǎn)物長度分布在730～810bp范圍內(nèi)(圖2)。

2.2 桑黃rDNA ITS序列分析

對桑黃rDNA I TS擴增目標位點進行回收、克隆、測序，結(jié)果表明本實驗分析的6個桑黃樣品序列精確長度分別為：Sh-01，812bp；Sh-02，637bp；Sh-03～Sh-06，772bp。通過GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對，Sh-01與P. baumii真菌rDNA ITS序列顯示最高的同源性比對結(jié)果，Sh-03～Sh-06與P. linteus的rDNA ITS同源性最高，而Sh-02與P. baumii、P. linteus及P. igniarius的rDNA ITS序列同源性均不顯著。依據(jù)Guglielmo等[13]公布的Phellinus屬真菌rDNA ITS序列為參照，對所有候選rDNA ITS序列進行界定，除去5＇端18S rDNA及3＇端28S rDNA，僅對ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域序列進行進分析。表2結(jié)果表明，桑黃真菌rDNA ITS序列長度區(qū)別明顯，其中ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域序列總長度分別為708～710bp(P. baumii)、668～671bp(P. linteus)、594～619bp (P. igni arius)；ITS1序列長度分別為308～310bp (P. baumii)、281～283bp(P. linteus)、214～233bp (P. igniarius)；5.8S序列長度完全一致，均為160bp；ITS2序列長度分別為240～241bp(P. ba umii)、227～229bp(P. linteus)、217～226bp(P. igniarius)。進一步對rDNA ITS序列的堿基構(gòu)成進行分析，發(fā)現(xiàn)不同桑黃真菌rDNA ITS序列中ITS1及ITS2區(qū)域GC含量明顯相異，這與rDNA IT S序列長度變異相一致。本實驗檢測的6株桑黃真菌中，rDNA ITS區(qū)域存在顯著差異，明顯區(qū)分為3類：1)Sh-01與P.baumii在rDNA ITS序列長度及堿基構(gòu)成方面基本一致；2)Sh-02的rDNA ITS區(qū)域構(gòu)成較為特殊，與P.baumii、P.linteus及P.igniarius及其余5株檢測桑黃真菌明顯相異；3)Sh-03、04、05、06的rDNA ITS區(qū)域構(gòu)成基本相同，且與P. linteus基本一致。

表 2 P. baumii,P. linteus和P. igniariusrDNA ITS序列長度及G+C含量變異分析Table 2 Variations in length and (G + C) content of rDNA ITS sequences inP. baumii,P. linteusandP. igniarius

2.3 基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對桑黃真菌rDNA ITS序列進行遺傳距離分析，從表3可看出，6株桑黃真菌存在明顯的遺傳分化：Sh-01與P. linteus、P. igniarius分別存在0.031、0.184的遺傳差異，與P. ba umii親緣關(guān)系最近；Sh-02明顯相異于其他桑黃真菌，遺傳距離在0.325～0.381間變動；Sh-03、04、05、06間不存在遺傳分化，為相同菌種，且與P. linteus親緣關(guān)系最近。

表 3 基于rDNA ITS序列的桑黃真菌遺傳距離分析Table 3 Interspecific and intraspecific genetic distances of Sanghuang

圖 3 基于桑黃真菌rDNA ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on rDNA ITS region sequences of Sanghuang

以P. tu berculosus(AM269806)、P. tr emulae (AM269804)、P. spiculosus(AY558648)、H. duportii (DQ404386)、T. versicolor(AY309018)、G. luci dum (FJ940919)為復(fù)合外組，依據(jù)rDNA ITS序列信息，應(yīng)用NJ法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。由圖3可知，所有桑黃真菌明顯聚為3個類群(Group Ⅰ，bootstrap=99%；G r o u p Ⅱ，b o o t s t r a p=1 0 0%；G r o u p Ⅲ，bootstrap=99%)。其中Group Ⅰ由P. linteus及Sh-03～Sh-06構(gòu)成，Group Ⅱ由P. baumii及Sh-01構(gòu)成，而Group Ⅲ則全部由P. igniarius構(gòu)成(未檢測到本實驗測定菌株)。同時，Sh-02明顯有別于銹革孔菌科的Out GroupⅡ(H. dup ortii)、Out G roupⅢ(P. tuberculosus、P. tremulae、P. spiculosus)菌種，而與Out GroupⅠ的T. versicolor(AY309018)顯示了相對較高的遺傳相似性并聚為一類(bootstrap=100%)。系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結(jié)果與供試菌種rDNA ITS區(qū)全序列信息分析的結(jié)果表現(xiàn)了較高的一致性，進一步說明了系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

3 討 論

長期以來真菌主要是依據(jù)其子實體形態(tài)特征進行鑒定，但是依據(jù)子實體形態(tài)對大型真菌的分類鑒定不僅受子實體生長環(huán)境、生長時期等客觀因素的影響，而且形態(tài)性狀的選取和判斷受主觀因素的影響也較大，因而基于形態(tài)性狀特征對大型真菌進行分類鑒定有一定的局限性，尤其是難以人工栽培的真菌，獲得作為分類依據(jù)的形態(tài)學特征較為困難。近年來，采用A F L P、RAPD、ITS序列分析等分子手段在真菌及植物的鑒定中得到廣泛的應(yīng)用，但是，RAPD在鑒定中重復(fù)性和可靠性都較差，AFLP對技術(shù)要求較高，且在一些物種的鑒定中靈敏性不夠，ITS r DNA區(qū)域進化速率較快，表現(xiàn)出廣泛的序列多態(tài)性，對高等植物及大型真菌的鑒定有更好的準確性和靈敏性，適用于不同分類水平的物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究[16-17]已成功應(yīng)用于Armillaria屬真菌[7]、Pneumocystis屬真菌[8]、Lactarius屬真菌[9]、Puccinia屬真菌[10]、Alnus屬真菌[11]等多種真菌的分子鑒定中。由于桑黃真菌物種間形態(tài)差異較小，同時培養(yǎng)條件下難以獲得子實體，鑒定工作較為困難[18-19]。利用rDNA ITS序列分析技術(shù)，可以直接提取蘊含于基因組內(nèi)的遺傳信息，檢測和比較出傳統(tǒng)形態(tài)學方法無法區(qū)分的相似菌株種間或種內(nèi)差別，研究不受生長階段和形態(tài)的限制，大大增加了鑒定的準確性和科學性，借助GenBank等生物數(shù)據(jù)庫的大量信息，從分子水平為桑黃的準確分類、鑒定提供科學依據(jù)。

對6份桑黃真菌rDNA ITS位點進行PCR擴增，通過電泳檢測已經(jīng)明顯區(qū)分出1份疑似菌種(Sh-02)，其余5份材料擴增片段分布在730～810bp范圍內(nèi)，且可大致

分為兩類(圖2)。通過克隆測序及序列比對，小片段樣品Sh-03～Sh-06(772bp)與P. linteus顯示最高的序列相似性，而大片段樣品Sh-01(812bp)與P. baumii顯示最高的序列相似性。通過對ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域序列進行分析發(fā)現(xiàn)，不同桑黃真菌rDNA ITS區(qū)域在序列長度、堿基構(gòu)成方面區(qū)別明顯(表2)，這與前人的研究結(jié)果相一致[7,10-11,20]。依據(jù)rDNA ITS序列信息構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，6份桑黃真菌明顯區(qū)分，獨立成組(圖3)。綜合桑黃真菌rDNA I TS序列長度變異、堿基構(gòu)成差異及系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，可以明確對測試的6份桑黃真菌樣品進行種級分類單元的鑒定：1)Sh-01、Sh-03分別與P. baumii、P. linteus發(fā)育關(guān)系最近，與P. igniarius顯著相異，將其分別正名為P. ba umii、P. lin teus；2) Sh-02與P. baumii、P. linteus、P. igniarius明顯相異，更是超越了P h e l l i n u s屬的界限，而與不同科的T. versicolor(AY309018)顯示了較高的遺傳相似性，可以明確將其鑒定為錯誤菌種；3)Sh-04、Sh-05與P. linteus發(fā)育關(guān)系最近，為同一物種；4)Sh-06與P. linteus發(fā)育關(guān)系最近，與保藏結(jié)構(gòu)認定相同。本實結(jié)果表明，rDNA ITS序列分析能夠有效地把桑黃真菌鑒定到種級分類單元，證明了基于rDNA ITS序列的分子鑒定在桑黃真菌基源物種的鑒定中是可行的，可以有效淘汰疑似菌種，確定同名異物以及同物異名菌株，在生產(chǎn)栽培以及產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。

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Molecular Identification of Medicinal Fungus Sanghuang based on rDNA ITS Sequence Analysis

XIE Li-yuan1,2，ZHANG Yong3,*，DENG Ke-jun3，PENG Wei-hong1，GAN Bing-cheng1，LI Hong-jun2
(1. Soil and Fertilizer Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；3. School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, China)

In this study, the ribosomal DNA internal transcribed spacer (rDNA ITS) region of six species of Sanghuang was cloned and sequenced, and the characteristics of ITS sequences were compared and analyzed. The ITS sequences exhibited homology through BLAST analysis of GenBank database and a phylogentic tree was constructed. Results demonstrated that phylogenetic relationship of Sh-03, 04, 05 and 06 was close to Phellinus linteus, and phylogenetic relationship of Sh-01 was close to Phellinus baumii; but Sh-02 had distant phylogenetic relationship with Phellinus baumii, Phellinus linteus and Phellinus igniarius. Therefore, the characteristics of rDNA ITS sequences can be used as an accurate, reliable and straightforward method to identify the original species of Sanghuang and explore genetic diversity.

Sanghuang；Phellinus baumii；Phellinus linteus；Phellinus igniarius；ribosomal DNA internal transcribed spacer；molecular identification

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0182-05

2009-08-12

四川省青年基金項目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撐項目(2008FZ0157)

謝麗源(1977—)，女，助理研究員，碩士，研究方向為食(藥)用菌加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：張勇(1977—)，男，副教授，博士，研究方向為遺傳學。E-mail：zhangyong916@uestc.edu.cn