驢乳中蛋白質組分的分離純化與鑒定

蘇 薇，楊 潔*，沈曉麗，蔣新月

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

驢乳中蛋白質組分的分離純化與鑒定

蘇 薇1，楊 潔2,*，沈曉麗3，蔣新月3

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

目的：分離純化并鑒定驢乳乳清中蛋白質組分，為進一步研究驢乳用于輔助治療疾病，以及為作為人乳替代品提供參考。方法：采用DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化驢乳乳清中蛋白質組分，并通過十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳法和高效凝膠滲透色譜法對所純化蛋白質進行鑒定。結果：與牛乳乳清中蛋白組分相對比，發(fā)現(xiàn)驢乳乳清中存在3種未知蛋白質，分子質量分別為32、70.1、72.2kD。結論：驢乳中除了含有與牛乳相似的營養(yǎng)成分外，還具有其他生物活性成分，它們可能是一些保護性蛋白，在機體的抗病機制方面起著重要作用。

驢乳；蛋白質組分；分離；純化

近年來，驢乳因其獨特的營養(yǎng)價值，已成為一種值得開發(fā)的寶貴資源，并作為一種新興的乳品引起了世界奶業(yè)研究人員的關注。有研究表明，驢乳具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，可作為牛乳蛋白過敏患者及嬰幼兒的營養(yǎng)品，并可以輔助治療動脈硬化，促進心血管疾病患者的康復[1-2]。驢乳中溶菌酶和乳糖的含量較高，有益于益生乳酸桿菌的生長，高含量的乳糖能促進腸對鈣的吸收，有利于在嬰幼兒時期骨骼的生長[3]。驢乳中脂質組成與人乳相似，其中亞油酸和亞麻酸含量較高[4-5]。同時，驢乳中礦物質含量和蛋白質總量也接近人乳和馬乳[6-7]。因而，驢乳的開發(fā)利用有著巨大的經(jīng)濟價值和社會價值。

本實驗采用DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化驢乳乳清中蛋白質組分，并通過十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對所純化蛋白質進行鑒定。以期為新疆驢乳用于輔助治療疾病，以及作為人乳替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢乳采自新疆烏魯木齊市郊區(qū)，-2 0℃儲藏；DEAE-52纖維素 Whatman公司；Sephadex G-100 Pharmacia公司；Fermentas非預染Marker 上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

BioLogic Lp層析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；真空冷凍干燥機 德國賀利氏公司；Heal Force NW系列超純水系統(tǒng) 上海力新儀器有限公司；Mini ProteinII 垂直電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Alphalmager2200凝膠處理及分析系統(tǒng) AlphaInnotech公司。

1.3 方法

1.3.1 驢乳蛋白的粗分[8]

驢乳4℃解凍，10000r/min離心15min脫脂。

脫脂乳與2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液等體積混合，用10%乙酸調pH 4.6，40℃水浴20min，8000r/min離心15min，收集上清液(乳清)，凍干、備用。沉淀(酪蛋白)用蒸餾水沖洗3次，凍干，備用。

1.3.2 離子交換層析分離驢乳乳清蛋白[9]

稱取凍干乳清粉約0.3g溶于5mL蒸餾水中，5000r/min離心10min，取上清液0.45μm微孔濾膜過濾，濾液加入DEAE-52層析柱(1.5cm×20cm)，用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8) 洗脫未被吸附的蛋白質，用含0.1～0.4 mol/LNaCl的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)連續(xù)洗脫被吸附的蛋白質，洗脫速度為0.5mL/min。收集洗脫峰，透析、凍干、備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳

將DEAE-52離子交換層析收集所得蛋白質洗脫峰的凍干粉，進行非連續(xù)SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠5%，分離膠為12%，恒流電流為15mA，電泳時間為1～2h。當染料距底邊1cm時，停止電泳。經(jīng)染色、脫色，將凝膠放入Alphalmager2200凝膠處理及分析系統(tǒng)中照相。

1.3.4 凝膠層析分離純化蛋白

Sephadex G-100層析柱(1.6cm×55cm)用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)平衡，洗脫速度為0.5mL/min，取DEAE-52柱層析的各洗脫峰收集所得蛋白凍干粉10mg分別溶于3mL磷酸鹽緩沖液，5000r/min離心10min，0.45μm微孔濾膜過濾，上樣，收集洗脫峰，透析，凍干，備用。

1.3.5 高效凝膠滲透色譜(HPGPC)[10]

采用TOSOH TSK-G4000PWXL (300mm×7.8mm)色譜柱對Sephadex G-100凝膠層析所得蛋白質洗脫峰的凍干粉進行檢測，流速為0.5mL/min，流動相為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)，檢測波長為280nm，進樣量為20μL。

標準蛋白的制備：標準蛋白(牛免疫球蛋白G：170 kD；甘氨酸氧化酶：150 kD；牛血清白蛋白：66.2 kD；卵清蛋白：45.0kD；胰蛋白酶：24kD；溶菌酶：14.4kD)分別溶于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)，質量濃度為1mg/mL，離心，0.22μm微孔濾膜過濾，加入TOSOH TSK-G4000PWXL (300mm×7.8mm)色譜柱進行檢測。

2 結果與分析

2.1 驢乳乳清蛋白的離子交換層析圖譜分析

圖1 乳清蛋白的DEAE-52離子交換層析圖Fig.1 DEAE-52 chromatographic fractionation of donkey s milk whey proteins

由圖1可知，DEAE-52離子交換層析對驢乳乳清蛋白進行分離純化，出現(xiàn)11個蛋白質峰。用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)洗脫，得到5個洗脫峰，即峰A、B、C、D、E；用含0.1～0.4mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)連續(xù)洗脫，得到6個洗脫峰，即峰F、G、H、I、J、K。

2.2 離子交換層析的SDS-PAGE電泳圖譜分析

圖2 DEAE-52離子交換層析各蛋白質峰的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of protein fractions of donkey s milk whey obtained after DEAE-52 chromatographic fractionation

通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測DEAE-52離子交換層析所得蛋白組分(圖2)，結果表明，只有峰G出現(xiàn)了一條單一蛋白條帶。而其余各峰均出現(xiàn)多條蛋白條帶，故需對所得蛋白質組分進一步分離純化。

2.3 凝膠層析分離純化蛋白圖譜分析

由于從DEAE-52離子交換層析收集所得蛋白組分得率較低，故只對部分蛋白組分進行Sephadex G-100凝膠層析。圖3～8為驢乳乳清蛋白經(jīng)DEAE-52離子交換層析所得部分洗脫峰的Sephadex G-100凝膠層析圖。峰A、H、I、K的洗脫曲線為單一峰(圖3、6、7、8)，命名為A1、H1、I1、K1。峰F存在2個洗脫峰(圖4)，說明其中存在2個不同分子量的蛋白組分F1、F2。峰G存在1個洗脫峰(圖5)，說明峰G為單一蛋白組分。峰J存在3個洗脫峰(圖7)，說明其中存在3個不同分子量的蛋白組分，分別命名為J1、J2、J3。

圖3 峰A的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.3 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak A

圖4 峰F的 Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.4 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak F

圖5 峰G的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.5 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak G

圖6 峰H的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.6 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak H

圖7 峰J和I的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.7 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peaks J and I

圖8 峰K的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.8 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak K

2.4 蛋白質分子質量的確定

根據(jù)5種標準蛋白質分子質量的對數(shù)值與TOSOH TSK-G4000PWXL(300mm×7.8mm)色譜柱中保留時間之間的線性相關關系，用Excel軟件繪制標準曲線為y=-0.0678x+2.9999，R2=0.9802。

SephadexG-100凝膠層析分離出部分蛋白組分的HPGPC圖譜(圖9～11)，根據(jù)標準蛋白質的標準曲線，可計算出洗脫峰中蛋白組分的分子質量，最終確定蛋白組分分子質量大小及相對應牛乳乳清中蛋白質名稱見表1。

圖9 峰A1、F1和G1的HPGPC圖譜Fig.9 HPGPC profiles of protein peaks A1, F1and G1

圖10 峰H1、I1和K1的HPGPC圖譜Fig.10 HPGPC profiles of protein peaks H1, I1and K1

圖11 峰J1、J2和J3的HPGPC圖譜Fig.11 HPGPC profiles of protein peaks J1, J2and J3

表1 驢乳乳清中蛋白質分子質量及相對應牛乳乳清中蛋白質Table 1 Identification of separated protein fractions of donkey s milk whey based on molecular mass alignment with cow s milk whey

由表1可以看出，峰A1中蛋白組分的分子質量接近于溶菌酶，峰F1和峰J2中蛋白組分的分子質量接近于牛血清白蛋白，峰H1和峰J3中蛋白組分的分子質量接近于β-乳球蛋白，峰K1中蛋白組分的分子質量接近于α-乳白蛋白。與牛乳乳清中蛋白組分相對比，發(fā)現(xiàn)驢乳乳清中存在3種未知蛋白質，分子質量分別為32、70.1、72.2kD。

3 結 論

驢乳作為一個新的研究領域，國內外研究主要集中在理化指標和營養(yǎng)特性等方面。Piccione等[11]發(fā)現(xiàn)驢乳中營養(yǎng)成分的日變化存在一定規(guī)律，脂肪和乳糖含量在夜晚達到高峰，而蛋白質含量在白天達到高峰。Vincenzetti等[12]對驢乳中蛋白質成分進行研究，發(fā)現(xiàn)驢

乳與其他乳類相比有低酪蛋白含量和高溶菌酶含量的營養(yǎng)特性。張巖春等[13]通過對驢乳與牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量進行比較，發(fā)現(xiàn)驢乳中α-乳白蛋白含量較高。張曉瑩等[14]對50頭新疆疆岳驢乳的化學成分以及微生物指標進行分析，結果表明，與牛乳相比驢乳各項指標更接近人乳。Criscione等[15]研究發(fā)現(xiàn)西西里島的驢乳中缺乏αs1-酪蛋白。Mao等[16]研究發(fā)現(xiàn)驢乳乳清蛋白中一些活性蛋白質組分對人肺癌細胞A549具有抗增生和抗腫瘤的作用，其分子質量大于10 kD，這些活性蛋白質組分能促進細胞分泌白細胞介素-2、干擾素-γ、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-β。驢乳中活性蛋白質組分不僅能直接抑制腫瘤增生，還可通過激活淋巴細胞和巨噬細胞間接殺死腫瘤細胞。

本研究針對新疆驢乳經(jīng)脫脂，等電點沉淀，分離得到乳清蛋白，采用DEAE-52纖維素層析和SephadexG-100凝膠層析分離出蛋白組分，并利用SDS-PAGE凝膠電泳和高效凝膠過濾色譜對所純化蛋白質進行鑒定。通過與牛乳乳清中蛋白質相對比，發(fā)現(xiàn)新疆驢乳中存在3種未知蛋白質，分子質量分別為32 、70.1kD和72.2 kD。這說明驢乳中除了含有與牛乳相似的營養(yǎng)成分外，還具有其他生物活性成分，它們可能是一些保護性蛋白，在機體的抗病機制方面起著重要作用。對于本實驗結果可以為深入系統(tǒng)地研究驢乳中的生物活性成分，并確定其藥用機理，以及開發(fā)驢乳產(chǎn)品，提高驢乳的利用價值等提供科學依據(jù)。也為闡明驢乳保護性蛋白含量及其生物學活性的獨特性，為驢乳保護性蛋白的新資源奠定基礎。

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Purification and Identification of Donkey ,s Milk Protein Fractions

SU Wei1，YANG Jie2,*，SHEN Xiao-li3，JIANG Xin-yue3
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046,China)

Objective: To provide a theoretical basis for further exploring the exploitability of donkey milk as an adjuvant for disease treatment or as a substitute for human milk. Methods: The protein fractions of donkey whey were separated and purified by DEAE-52 anion-exchange chromatography and Sephadex G-100 gel-filtration chromatography. The purified protein fractions were identified by SDS-PAGE and high-performance gel permeation chromatography. Results: Three unknown proteins having molecular masses of 32, 70.1 kD and 72.2 kD were found to be present in donkey whey in comparison with the protein composition profile of cow s milk whey. Conclusion: Along with the similar nutritional components to those in cow s milk, other bioactive components were also contained in donkey s milk, which might be some protective proteins playing an important role in protecting the organism against diseases.

donkey s milk；protein fraction；separation；purification

TS252

A

1002-6630(2010)23-0044-05

2010-09-28

蘇薇(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為生化工程。E-mail：suwei658@sina.com

*通信作者：楊潔(1963—)，女，副教授，博士研究生，研究方向為生物化學。E-mail：xindayangjie@sina.com