高效液相色譜法檢測豬肉中安眠酮殘留量

呂 飛，朱事康，黃 剛，曹維強，吳云普

(惠州出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 惠州 516006)

高效液相色譜法檢測豬肉中安眠酮殘留量

呂 飛，朱事康，黃 剛，曹維強，吳云普

(惠州出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 惠州 516006)

建立高效液相色譜法 (HPLC)檢測豬肉中安眠酮殘留量。經(jīng)過實驗確定用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動相定容后用高效液相色譜儀測定；采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動相，226nm為測定波長，1.0mL/min的流速。在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限為0.020mg/kg，回收率在70%～110%之間，標準曲線回歸方程為Y=6.90×104X+3.71×103，相關(guān)系數(shù)為0.999。此法操作簡便、快速、靈敏、準確，樣品處理簡便易行，適用于測定豬肉中的安眠酮。

高效液相色譜法；豬肉；安眠酮；固相萃取

安眠酮(methaqualone)，又稱甲苯喹啉酮。分子式C16H14N2O，相對分子質(zhì)量250.29。白色結(jié)晶粉末。無臭、微苦。熔點120℃。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等。有吸濕性、有鎮(zhèn)靜和催眠作用，適用于精神性失眠。

農(nóng)業(yè)部公布的《食用動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中有21類近40個品種的原料藥及其單方、復(fù)方制劑產(chǎn)品停止使用，其中安眠酮也位列其中。安眠酮系喹唑酮類衍生物，臨床上常用作催眠藥、鎮(zhèn)定藥[1]，主要用于動物過度興奮或驚厥，可使機體平靜。但該藥副作用較大，消費者誤食了含有安眠酮的豬肉，會表現(xiàn)出惡心、嘔吐、頭暈、無力、四肢及口舌麻木，個別較重患者有短時間的精神失常。過量中毒可出現(xiàn)昏迷、視神經(jīng)乳頭水腫、心跳過速、呼吸抑制等癥狀。久吃含有此藥的肉類，人體可產(chǎn)生耐藥性。近年來，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，一些不法分子在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下，置法律法規(guī)于不顧，擅自在畜禽飼養(yǎng)中添加使用，從而嚴重影響人們的身體健康。目前，在國內(nèi)動物源性食品中安眠酮殘留量的檢測還沒有相關(guān)的檢驗標準[2-3]。本實驗采用二氯甲烷提取，用高效液相色譜儀檢測，建立動物源性食品中安眠酮殘留量的測定方法，以期為動物源性食品的質(zhì)量控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬瘦肉 惠州東進肉聯(lián)廠。

安眠酮標準品(純度＞99.0%，質(zhì)量濃度10.000mg/L)；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷(均為色譜純)德國Meker公司；乙腈飽和正己烷(色譜純)；乙酸胺、氫氧化鈉、無水硫酸鈉(均為分析純)；凈化用洗脫液：

乙腈+丙酮(體積比1:1)。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(帶2487紫外-可見波長檢測器或2998二極管陣列檢測器)、Empower 2 工作站、固相萃取裝置、HLB C18SPE(3cc，60mg) 美國Waters公司；717Plus 自動進樣器 德祥科技有限公司；3-18K型離心機 Sigma公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Buchi公司；濾膜、快速定性濾紙。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

精確移取安眠酮標準品1.000mL，用乙腈稀釋并定容至10mL，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為1.000mg/L的標準儲備液。精確吸取標準儲備液2.0、5.0、10、20mL分別置于100mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，使質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20mg/L的標準使用液，使用前配制。以組分的峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，以外標法定量。

1.3.2 色譜分離條件

色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)；測定波長為226nm；流動相為乙腈:乙酸胺 (25mmol/L)=40: 60(V/V)；流速1.0mL/min；進樣量20μL；柱溫40℃。

1.3.3 樣品處理

1.3.3.1 提取

稱取5.0g(精確到0.01g)組織樣品和10g無水硫酸鈉于50mL離心管中，加入1mL 1mol/L NaOH溶液和20mL二氯甲烷，均質(zhì)提取1min，4000r/min離心5min，上清液經(jīng)快速定性濾紙過濾到100mL濃縮瓶中，殘渣用20mL二氯甲烷超聲提取10min，4000r/min離心5min，合并二氯甲烷，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

1.3.3.2 凈化

殘留物中加入1mL流動相，充分旋渦振蕩，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，棄去上層正己烷層，原離心管中再加入3mL乙腈飽和正己烷，旋渦混勻，4000r/min離心5min，下層加0.1mol/L的NaOH溶液稀釋至5mL，作為待凈化液以備用。用3mL甲醇，3mL 0.1mol/L的NaOH以1mL/min的流速淋洗活化萃取柱，然后將5mL待凈化液通過柱子(控制流速小于0.5mL/min)，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液，3mL甲醇以1mL/min的流速過柱洗雜，最后用5mL乙腈-丙酮(體積比1:1)洗脫(控制流速小于0.5mL/min)，收集洗脫液于25mL濃縮瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1mL流動相溶解殘渣，溶液過0.45μm有機相濾膜后上高效液相色譜儀測定。

1.3.4 樣品測定

取供上機檢測的樣品溶液20μL，注入高效液相色譜儀。根據(jù)樣液中安眠酮含量的情況，選取相應(yīng)值相近的標準工作溶液，標準工作溶液和待測樣液中安眠酮含量的相應(yīng)值均應(yīng)在儀器的線性范圍內(nèi)，對標準工作溶液和樣液等體積參插進樣測定。與標準的保留時間比較定性，外標法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的預(yù)處理

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于安眠酮易溶于乙醇、乙醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿5種試劑做回收率比對實驗，回收率分別為70.1%、82.5%、83.7%、91.4%、89.8%。二氯甲烷的回收率最高，所以用二氯甲烷作提取液。

2.1.2 樣品溶液pH值的調(diào)節(jié)[4]

安眠酮在弱堿性條件下更易溶于有機溶劑，考慮在提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值在8～9之間。分別做回收率比對實驗，回收率為87.5% (pH8～9)和80.3%(未調(diào)pH值)，所以選擇在樣品提取液中加入了1mL 1mol/L NaOH溶液，控制pH值在8～9之間。

2.1.3 凈化時殘渣溶解液的選擇

選用二氯甲烷、乙腈及流動相溶解殘留物。用二氯甲烷溶解時與正己烷互溶，嚴重的影響樣品的回收，不予考慮；用乙腈溶解時，雜質(zhì)干擾峰較多，綜合考慮采用流動相溶解效果最好。

2.1.4 萃取柱凈化[5-7]

由于動物肌肉中通常含有脂肪，首先需要脫脂步驟，在提取溶劑中加入正己烷，去除脂類雜質(zhì)。若基質(zhì)比較干凈，則可直接裝瓶上機；若干擾峰較多，則要進行固相萃取柱萃取。對OasisHLB、MCX、MAX不同極性的萃取柱進行方法實驗，結(jié)果表明：OasisHLB得到的回收率較高且穩(wěn)定，通過上柱條件，淋洗，洗脫各條件實驗，最終確定的固相萃取條件如下：樣液轉(zhuǎn)移至已預(yù)先用3mL甲醇活化、3mL 0.1mol/L NaOH溶液平衡的OasisHLB固相萃取柱中，依次用3mL 0.1mol/L的NaOH溶液和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用洗脫液洗脫。實驗表明，采用OasisHLB固相萃取柱處理樣品除雜質(zhì)效果好，分析物有高回收率、重現(xiàn)性好。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相的選擇[8-9]

在所有條件相同的情況下，進相同質(zhì)量濃度的標準溶液。比較甲醇-水和乙腈-乙酸胺(25mmol/L)這兩種流動相，分別取甲醇-水體積比為40:60、50:50、30:70，此流動相在這3個比例的條件下均未出峰；乙腈-乙酸胺(25mmol/L)的體積比為30:70、45:55、40:60、75:25、

90:10、15:85，比較峰面積(圖1)，表明適合以乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動相。2.2.2檢測波長的選擇

圖1 流動相比例與峰面積對應(yīng)關(guān)系柱形圖Fig.1 Relationship between mobile phase composition and peak area of methaqualone

在 200～400nm 范圍內(nèi)對安眠酮標準溶液進行掃描，安眠酮在 206、226、266、306、318nm 處有 5 個依次變低的吸收峰。參照文獻[8]最終確定檢測波長為226nm。2.2.3色譜條件的確定[10]

考慮到Sunfire C18色譜柱針對堿性化合物能有效地改善分離度，在低和中等pH值流動相條件下，對酸性、中性和堿性化合物都有杰出的柱效。且實驗表明分離效果理想。在目標峰附近無干擾峰。經(jīng)實驗采用的色譜條件為：色譜柱為Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)、柱溫為40℃、流動相為乙腈-乙酸胺(25mmol/L)溶液(40:60，V/V)，流速為1.0mL/min，檢測器為紫外檢測器或二極管陣列檢測器，檢測波長為226nm，進樣量為20μL，安眠酮的保留時間約為8min左右，所得色譜峰峰形較好，并且實現(xiàn)了安眠酮與雜質(zhì)的良好分離。2.3標準色譜圖和樣品加標色譜圖

3 結(jié) 論

圖2 安眠酮標準品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of methaqualone standard

圖3 加標樣品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of a spiked sample

按照2.2.3節(jié)條件進行色譜分析得到安眠酮的色譜圖，圖2為安眠酮的標準色譜圖，出峰時間在7.5min左右；圖3為豬肉樣0.020mg/kg標品添加量回收色譜圖。

2.4 方法的線性關(guān)系

安眠酮在0.02～0.20mg/L內(nèi)線性關(guān)系顯著。以峰面積-質(zhì)量濃度作圖，得到標準曲線回歸方程為Y=6.90× 104X+3.71×103，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.5 最低檢測限

在RSN=3條件下確定安眠酮最低檢測限為0.020mg/kg。

2.6 方法的加標回收率

表1 樣品加標平均回收率(n=6)Table 1 Inter-and intra-laboratory average recovery rates of methaqualone (n=6)

由表1可見，在添加量在0.020～0.20mg/kg范圍內(nèi)，回收率在70%～110%之間，RSD在2.32%～3.90%之間，回收效果較好。

本實驗旨在建立安眠酮的高效液相色譜檢測方法。用二氯甲烷提取，固相萃取(SPE)柱凈化，流動相定容后用高效液相色譜儀測定。采用乙腈:乙酸胺溶液(25mmol/L)=40:60(V/V)為流動相，226nm為測定波長，1.0mL/min的流速色譜分析條件，可以實現(xiàn)動物組織中安眠酮的檢測。此法操作簡便、快速、靈敏、準確，樣品處理簡便易行，適用于測定豬肉中的安眠酮。

[1]郭幼梅, 諸秋珉, 姜宴. 用HPLC法同時檢測生物檢材中安眠酮及其2-羥甲基代謝物[J]. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1996, 23(1): 43-45.

[2]員克明, 李貴明, 王英元, 等. 安眠酮薄層色譜掃描檢測研究[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志, 1997, 12(1): 25-26.

[3]宋鳳瑞, 劉淑瑩. 安眠鎮(zhèn)靜藥物的串聯(lián)質(zhì)譜分析方法[J]. 分析化學(xué), 1998, 26(11): 1394-1396.

[4]馮翠玲, 劉陰棠, 羅毅. 兩種檢測器兩種色譜柱對21種安眠鎮(zhèn)靜藥物的系統(tǒng)分析[J]. 藥物分析雜志, 1994, 14(5): 3-6.

[5]汪麗萍, 邱月明, 趙海香, 等. 鎮(zhèn)靜劑殘留分析的樣品前處理技術(shù)研究進展[J]. 藥物檢測, 2004, 21(4): 28-29.

[6]邢若葵, 溫錦鋒, 王松才, 等. 自動固相萃取法(SPE)提取常見安眠鎮(zhèn)靜藥[J]. 刑事技術(shù), 2003(3): 12-15.

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Determination of Methaqualone Residues in Pork by High Performance Liquid Chromatography

(Center of Comprehensive Technology, Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huizhou 516006, China)

A high performance liquid chromatographic method was established to determine the content of methaqualone residues in pork. Sample extraction was carried out using dichloromethane as the extraction solvent, followed by clean-up on a solid-phase extraction column and dillution to a certain volum with the mobile phase composed of acetonitrile and 25 mmol/L ammonium acetate before injection onto HPLC system. The detection wavelength was 226 nm and the mobile phase flow rate was 1.0 mL/min. The calibration curve of the developed method was as follows: Y = 6.90 × 104X +3.71 × 103, with a correlation coefficient of 0.999, which exhibited good linearity over the concentration range from 0.020 to 0.20 mg/kg. The detection limit was 0.020 mg/kg, and the inter- and intra-laboratory average spike recovery rates of methaqualone at three levels were between 70% and 110%. This method has the benefits of simplicity, rapidity, high sensitivity, convenience and good feasibility and most suitable for the determination of methaqualone residues in pork.

high performance liquid chromatography；pork；methaqualone；SPE

TS207.3；R155.5

A

1002-6630(2010)18-0295-03

2009-12-16

呂飛(1978—)，女，工程師，在職碩士研究生，主要從事食品檢驗研究。E-mail：lvfei1026@163.com