高大文，梁 紅，李保深，陳 軍

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱150090，gaodw@hit.edu.cn; 2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040)

白腐菌是一類具有引起木質(zhì)白色腐爛功能的絲狀真菌的總稱，白腐菌是目前己知能夠?qū)⒛举|(zhì)素徹底降解為二氧化碳和水的唯一生物，因此，近年來受到廣泛關(guān)注，將其應(yīng)用到解決環(huán)境中持久性有機污染物的降解中［1－3］.白腐菌降解木質(zhì)素依賴于其分泌的木質(zhì)素降解酶，主要包括木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac).漆酶是一類含銅的多酚氧化酶，于1883年由日本吉田首次從漆樹中發(fā)現(xiàn)［4］.漆酶廣泛存在于真菌中，尤其是白腐真菌，是重要的產(chǎn)漆酶菌［5］.由于漆酶能夠催化許多芳香族化合物和其他底物分解，很快成為環(huán)境保護研究領(lǐng)域的熱點［6］，如用于有毒有害物質(zhì)的降解［7］、染料脫色［8］及土壤中雜芬油類物質(zhì)的去除［9］等.

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上［10－12］，為開發(fā)本土白腐真菌資源，選用東北林區(qū)廣泛分布的糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)為研究對象，采用正交試驗對此菌株的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，進而獲得最佳的培養(yǎng)基組成，并與目前普遍采用的TK培養(yǎng)基做對比，為更好地將此菌株應(yīng)用于環(huán)境污染治理奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)支持.

1 試驗

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

白腐 真 菌 － 糙 皮 側(cè) 耳 菌 (Pleurotus ostreatus).

1.1.2 培養(yǎng)基

1)固體培養(yǎng)基:土豆液20%，葡萄糖20 g/L，瓊脂 20 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.01 g/L.

2)TK培養(yǎng)基:參照Tien＆Kirk培養(yǎng)基配制［13］.

3)試驗用培養(yǎng)基:在TK培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇不同種類的碳源和氮源，選取不同的碳源和氮源質(zhì)量濃度，按照正交表配制.

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)經(jīng)培養(yǎng)箱25℃活化3 d，從斜面接種于固體培養(yǎng)基的平板上，7 d左右待糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)長滿整個平板后，用無菌打孔器打成直徑為10 mm的菌片，接種于含有50 mL液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，接種量為3片，在120 r/min、25℃的條件下進行搖床培養(yǎng)，定時取樣測定生物量和漆酶酶活力.

1.2.2 正交試驗

糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)產(chǎn)漆酶的液體培養(yǎng)基采用四水平五因素正交試驗，L16(45)正交表見表1.

表1 正交試驗因素水平表

1.2.3 粗酶液的制備、漆酶活力和生物量的測定參見文獻［14］.

2 結(jié)果與分析

2.1 糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

2.1.1 正交試驗結(jié)果

按L16(45)正交表進行正交試驗，以漆酶為評價指標(biāo)，平均最高產(chǎn)酶結(jié)果見表2.

表2 正交試驗產(chǎn)漆酶(Lac)結(jié)果

試驗結(jié)果表明，有機碳源類型培養(yǎng)基相對于無機碳源類型培養(yǎng)基的平均最高酶活較高.初步判斷有機碳源利于產(chǎn)酶.14號樣產(chǎn)酶量相對于其他15個試驗號樣產(chǎn)酶量要高，平均最高酶活達到149.45 U/L.

2.1.2 結(jié)果分析

通過對正交試驗數(shù)據(jù)進行直觀分析得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基的成分組成為:碳源為玉米粉，其質(zhì)量濃度為 8 g/L，氮源為氯化銨，其質(zhì)量濃度為0.88 g/L，培養(yǎng)基中的其他成份為KH2PO40.2 g/ L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl2·2H2O 0.01 g/ L，維生素0.5 mL/L，Tween80 0.9 mL/L，無機溶液1 mL/L，pH=6.

通過極差分析，可以排列出各因素對白腐真菌分泌漆酶影響大小的順序.圖1為各因素的水平－指標(biāo)均值.可以看出，A因素:在試驗選取的4種碳源中，玉米粉最有利于產(chǎn)漆酶，當(dāng)其質(zhì)量濃度為8 g/L時對產(chǎn)酶的促進作用最大.玉米粉在培養(yǎng)基成分中屬于有機碳源，其浸出液能促進漆酶的分泌［15］.而無機碳源蔗糖能支持菌的生長，不能促進漆酶的分泌.B因素:試驗中選取的4種氮源，氯化銨最利于產(chǎn)漆酶;說明白腐真菌(Pleurotus ostreatus)更易于利用無機氮源，而有機氮需要分解成無機氮才被利用［16］.C因素:試驗選取不同碳源質(zhì)量濃度中，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 g/L時產(chǎn)漆酶最高.D因素:4種氮源質(zhì)量濃度中，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.11 g/L時產(chǎn)漆酶最高;氮源是影響漆酶分泌的一個重要因素，高碳氮質(zhì)量濃度比有利于漆酶的分泌［17］.E因素看作空白列，有利于后期做數(shù)據(jù)分析時進行方差分析，根據(jù)本試驗室的相關(guān)研究選取pH=6.通過極差分析，得出各因素對產(chǎn)漆酶影響依次為:碳源種類＞碳源質(zhì)量濃度＞氮源質(zhì)量濃度＞氮源種類.

圖1 各因素的水平－指標(biāo)均值

用SPSS軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析得出碳源類型對漆酶影響顯著.此外，F(xiàn)X檢驗可知，因素水平的改變對指標(biāo)的影響超過了試驗誤差引起的影響，試驗條件改變引起的以漆酶酶活為試驗指標(biāo)的數(shù)據(jù)波動不是由試驗誤差引起的，而是由試驗所選的因素水平的不同所引起的，各因素不同水平之間對試驗結(jié)果有顯著性的差異.

上述分析結(jié)果與直觀分析和極差分析得出的結(jié)果一致.從直觀分析結(jié)果可以看出，正交試驗得出結(jié)果是14號樣產(chǎn)酶量最高，那么該試驗條件下各因素所在的水平應(yīng)該優(yōu)于其他試驗條件下各因素所在的水平，即各因素都存在一個最優(yōu)水平，各因素不同水平之間對試驗結(jié)果也應(yīng)該存在著差異.上述方差分析的結(jié)果充分肯定了各因素不同水平之間的這種差異，說明了這些差異是真實存在的，而不是由試驗誤差引起的.

2.2 優(yōu)化后培養(yǎng)基產(chǎn)酶情況同TK培養(yǎng)基產(chǎn)酶比較

比較優(yōu)化培養(yǎng)基和目前普遍采用的TK培養(yǎng)基在培養(yǎng)糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)的產(chǎn)酶情況.從圖2可以看出，優(yōu)化的培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶酶活明顯高于TK培養(yǎng)基，酶活峰值達149.45 U/L，而TK培養(yǎng)基的酶活峰值僅為50.00 U/L，優(yōu)化后的培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶酶活是TK培養(yǎng)基的3倍.

根據(jù)以上分析，建議做更深入的碳源優(yōu)化，碳源類型是對糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)產(chǎn)漆酶影響最大的因子，找出合適的碳源種類是研究此菌種分泌漆酶最佳培養(yǎng)基的關(guān)鍵.

圖2 不同培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶情況

2.3 白腐真菌生長與產(chǎn)酶的關(guān)系

白腐真菌的生長狀態(tài)關(guān)系到其分泌漆酶酶活的高低，只有當(dāng)生物量達到一定程度時，白腐菌才開始分泌漆酶.基于此，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對糙皮側(cè)耳菌的生長與產(chǎn)酶關(guān)系進行了研究，結(jié)果如圖3所示.

圖3 糙皮側(cè)耳菌的生長和產(chǎn)酶關(guān)系

糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)在前期生長過程中酶活和生物量均隨時間增加而升高，第6天時菌體生長達到最大值，第7天時漆酶酶活達到最高值，兩者在峰值出現(xiàn)的時間上并不一致，該研究結(jié)果與前期研究的另一種白腐真菌——偏腫擬栓菌的結(jié)果相同［14］.由此可以說明漆酶的分泌具有滯后性.因此，有關(guān)土著白腐真菌的酶學(xué)特性仍需進一步研究.

3 結(jié)論

1)有機碳源類型的培養(yǎng)基更利于糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)產(chǎn)漆酶，該菌株最佳產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基組成為:碳源為玉米粉，質(zhì)量濃度為8 g/ L，氮源為氯化銨，質(zhì)量濃度為0.88 g/L.通過極差分析，得出各因素對產(chǎn)漆酶影響依次為:碳源種類＞碳源質(zhì)量濃度＞氮源質(zhì)量濃度＞氮源種類.同時方差分析的結(jié)果也進一步證明碳源種類對產(chǎn)酶影響更顯著.

2)糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)在經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶酶活最大值為149.45 U/ L，而在文獻中普遍采用的TK培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶酶活最大值僅為50.00 U/L，因此，優(yōu)化后培養(yǎng)基提高了糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)的產(chǎn)漆酶能力近3倍.

3)糙皮側(cè)耳菌(Pleurotus ostreatus)的最大生長量時間與其分泌漆酶的峰值時間并不一致，表現(xiàn)為其分泌漆酶具有一定的滯后性，因此，有關(guān)土著白腐真菌的酶學(xué)特性仍需進一步研究.

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