龐 勇,陳麗容,馮 卓,暢英才,吳 剛

(廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,廣西南寧 530023)

白細(xì)胞介素(IL)是主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生的一組免疫活性因子,作用于白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞,發(fā)生多種生物學(xué)效用,共同參與機(jī)體免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)[1]。近年來的基礎(chǔ)和臨床實驗發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注過程中,IL的表達(dá)明顯增加,作用于白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等,參與缺血性腦損傷的病理生理過程。本實驗以腦缺血再灌注大鼠腦組織和血清中白細(xì)胞介素 -10(IL-10)的含量變化為指標(biāo),研究針刺抗腦缺血后炎性損傷的機(jī)制,旨在證明增強(qiáng) IL-10的表達(dá)來抑制炎性細(xì)胞的大量分泌,從而改善微循環(huán),促進(jìn)大腦血供,有利于大鼠腦神經(jīng)功能的恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年 SD大鼠,雄性,體重(260±30)g,普通級,共 110只,由廣西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 動物模型制備 將大鼠以 3%戊巴比妥(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定于手術(shù)臺上,取頸部正中切口,鈍性分離甲狀腺,將其上翻并加予保護(hù),分離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA),用絲線結(jié)扎 ECA和 CCA近心端,于ECA處置一動脈夾,參照改良 Zea bonga方法,于 CCA近分叉處剪一約 0.2 mm側(cè)“V”形切口,插入栓線,插入深度約 18.5 mm,使栓線進(jìn)入 ICA,越過大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)開口處,到達(dá)大腦前動脈(anterior cerebral artery,ACA)起始部,阻斷大腦中動脈的所有血液來源,扎緊備線,甲狀腺復(fù)位,關(guān)閉并縫合皮膚切口。術(shù)中室溫保持在 25℃。術(shù)后用白熾燈照射,溫度控制在 37℃給大鼠保溫。

1.3 神經(jīng)癥狀行為學(xué)檢測 大鼠清醒后 1～2 h采用Longa等[2]的 5分制標(biāo)準(zhǔn)評分。0分：無神經(jīng)缺損癥狀;1分：不能伸展對側(cè)前爪;2分：行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：向偏癱側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走,意識喪失。將造模成功(2～3分)的大鼠用于實驗。

1.4 實驗動物分組及治療方法

1.4.1 實驗分組 將大鼠隨機(jī)分成 11組,每組 10只。正常組：不予任何處理;假手術(shù)組：將線插入后隨即拔出;模型 12 h組：腦缺血 1 h/再灌注 12 h;模型 24 h組：腦缺血 1 h/再灌注 24 h;模型 48 h組：腦缺血 1 h/再灌注 48 h;普通針刺組 12 h組：腦缺血 1 h/再灌注 12 h同時進(jìn)行普通針刺;普通針刺組 24 h組：腦缺血 1 h/再灌注 24 h同時進(jìn)行普通針刺方法;普通針刺組 48 h組：腦缺血 1 h/再灌注 48 h同時進(jìn)行普通針刺方法;益腎調(diào)督針法 12 h組：腦缺血 1 h/再灌注 12 h同時進(jìn)行益腎調(diào)督針法;益腎調(diào)督針法 24 h組：腦缺血 1 h/再灌注 24 h同時進(jìn)行益腎調(diào)督針法;益腎調(diào)督針法 48 h組：腦缺血1 h/再灌注 48 h同時進(jìn)行益腎調(diào)督針法。

1.4.2 治療方法 (1)正常組：不予任何處理。(2)假手術(shù)組：將線插入后隨即拔出。(3)模型組：造成局灶性腦梗塞模型不做針刺治療。(4)益腎調(diào)督針法組：針刺百會、風(fēng)府、大椎、命門、腎俞、太溪。后兩穴用患側(cè)。方法：手捻針,百會、風(fēng)府、大椎用平補(bǔ)平瀉手法,命門、腎俞、太溪用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法,留針 30 min,每 5 min行針 1次。(5)普通針刺組：針刺患側(cè)合谷、曲池、足三里、昆侖。手捻針,平補(bǔ)平瀉手法,留針 30 min,每 5 min行針 1次。12 h針刺組于手術(shù)后 1 h針刺,處死前蓄積 1次;24、48 h針刺組 1日針兩次,處死前蓄積 1次。

1.5 標(biāo)本收集 每只造模成功的大鼠在規(guī)定的時間點麻醉,開胸暴露心臟,自右心房取血 2 ml,4℃過夜,然后 2000 g/min離心 20 min,取上清封存,置于-20℃冰箱待測;同時,用 0.9%生理鹽水及 4%多聚甲醛各 200 ml作心臟灌注固定,斷頭取腦,分開兩側(cè)大腦半球,在右側(cè)距額極 2.5 mm處向后切取 2.5 mm腦組織,稱重,按 0.1 g∶l ml的比例加 4%多聚甲醛作腦組織勻漿 2000 g/min離心 20 min,取上清封存,置于 -20℃冰箱待測。

1.6 白細(xì)胞介素 -10的測定 白細(xì)胞介素 -10的測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,EILSA),試劑盒的使用嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用專業(yè)統(tǒng)計軟件包 SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計,所有數(shù)據(jù)均采用±s表示。各組差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),繼以 LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MCAO大鼠血清中 IL-10含量的變化及針刺的影響 見表 1。

表1 各組大鼠血清中 IL-10含量 (±s,n=10)

表1 各組大鼠血清中 IL-10含量 (±s,n=10)

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與同時段模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與同時段益腎調(diào)督組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 IL-10(μg/ml)正常組 20.78±2.11假手術(shù)組 20.92±2.13**12 h模型組 23.03±2.28**12 h益腎調(diào)督組 30.56±3.13**▲▲12 h普通針刺組 26.70±3.00**▲▲##24 h模型組 27.26±2.59**24 h益腎調(diào)督組 42.73±2.93**▲▲24 h普通針刺組 36.96±2.12**▲▲##48 h模型組 35.70±2.18**48 h益腎調(diào)督組 50.10±2.34**▲▲48 h普通針刺組 44.42±1.89**▲▲##

2.2 MCAO大鼠腦組織中 IL-10含量的變化及針刺的影響 見表 2。

從表 1、表 2可以看出,與正常組比較,模型組、益腎調(diào)督組、普通針刺組腦組織與血清中 IL-10含量顯著上升,而假手術(shù)組比較差異無顯著。與同時段模型組比較,益腎調(diào)督組、普通針刺組在各時相差異具有顯著性。同時段普通針刺組與益腎調(diào)督組比較,差異具有顯著性意義,說明兩組針法均能提高大鼠缺血后 IL-10的含量,尤以益腎調(diào)督組增加顯著。

表2 各組大鼠腦組織中IL-10含量 (±s,n=10)

表2 各組大鼠腦組織中IL-10含量 (±s,n=10)

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與同時段模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與同時段益腎調(diào)督組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 IL-10(pg/ml)正常組 20.12±2.17假手術(shù)組 19.90±1.64**12 h模型組 24.97±1.42**12 h益腎調(diào)督組 33.64±2.35**▲▲12 h普通針刺組 30.16±2.61**▲▲##24 h模型組 34.69土 2.53**24 h益腎調(diào)督組 47.04±2.84**▲▲24 h普通針刺組 40.85±2.31**▲▲##48 h模型組 24.97±1.46**48 h益腎調(diào)督組 71.91±3.42**▲▲48 h普通針刺組 54.55±2.77**▲▲##

2.3 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷評分比較 見表3。

從表 3可以看出,與正常組比較,模型組、益腎調(diào)督組、普通針刺組差異顯著,而假手術(shù)組比較差異不顯著;各時相上模型組動物神經(jīng)功能缺損癥狀隨時間延長逐漸減輕,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;益腎調(diào)督組與模型組在各時相上的 NSS比較,差異均具有顯著性差異,而普通針刺組與模型組在各時相上的 NSS比較,以24 h、48 h差異有顯著意義(P＜0.05)。益腎調(diào)督組與普通針刺組在各時相上的 NSS比較,以同時段 48h比較差異有顯著意義(P＜0.05),說明益腎調(diào)督針法與普通針刺方法均能提高大鼠缺血后神經(jīng)功能損傷的恢復(fù),而益腎調(diào)督針法更有利于大鼠神經(jīng)肢體功能的恢復(fù)。

表3 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷評分比較 (±s)

表3 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷評分比較 (±s)

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與同時段模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與同時段益腎調(diào)督組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 例數(shù) 12 h 24 h 48 h正常組 10 0 - -假手術(shù)組 10 0 - -模型組 10各亞組 2.4±0.51** 2.4±0.51** 2.2±0.63**益腎調(diào)督組 10各亞組 1.9±0.56**▲ 1.5±0.52**▲▲ 1.3±0.48**▲▲普通針刺組 10各亞組 2.2±0.42** 1.9±0.31**▲ 1.8±0.42**▲#

3 討論

本實驗結(jié)果表明在急性腦缺血早期,IL-10的含量在 3個觀察的時間點均高于正常水平,隨著時間的延長 MCAO神經(jīng)功能缺損癥狀隨時間延長逐漸減輕,可推測,可能在急性腦缺血早期 IL-10發(fā)揮抑制促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β,TNF-a,IL-6)等的表達(dá),從而抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)以及免疫損傷,減少腦缺血后神經(jīng)元的壞死,這與文獻(xiàn)[3,4]報道相似。此外,施予針灸治療后,MCAO大鼠血清及腦組織中的 IL-10含量較沒有施予針灸治療的 MCAO大鼠明顯升高,且MCAO神經(jīng)功能缺損癥狀減輕程度均較沒有施予針灸治療的 MCAO更明顯。因此,可推測針灸在急性腦缺血早期可增高血清及腦組織中的 IL-10的含量,從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元、防治腦缺血損害的作用。

研究還表明,益腎調(diào)督針法與普通針刺法均能夠不同程度的提高 MCAO血清及腦組織中 IL-10的含量,達(dá)到抑制炎性細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集和激活,而抑制細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放,從而改善微循環(huán),促進(jìn)大腦血供,利于大鼠腦神經(jīng)功能恢復(fù)的作用,而兩種針法比較以益腎調(diào)督針法效果更為顯著,是臨床上值得進(jìn)一步推廣和運用的減少腦缺血損害的一種有效的針灸療法。

此外筆者在研究中還發(fā)現(xiàn),血清及腦組織 IL-10在急性腦缺血形成后含量呈動態(tài)變化。本實驗測定了腦缺血后 12 h、24 h及 48 h血清及腦組織中 IL-10水平：缺血后 12 h IL-10表達(dá)較低,24 h及 48 h兩個時間點表達(dá)顯著增高,這與 Li HL[5]等測定持續(xù) MCAO大鼠腦 IL-17、IFN-Y和 IL-10mRNA表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)缺血后 1-12 hIL-10mRNA表達(dá)較低,24 h～6天逐漸升高的報道相符。筆者認(rèn)為,腦缺血 12 h內(nèi)由于大量的炎性因子開始分泌,而 IL-10在 12 h內(nèi)分泌較少而消耗較多,因此 12h IL-10表達(dá)較低;可能是受血循環(huán)中 TNF-α等炎性因子的持續(xù)刺激,IL-10在 24 h及 48 h表達(dá)顯著增高,而進(jìn)行針灸治療后,IL-10在血清及腦組織中的表達(dá)更明顯的增高,因此本實驗也證明了腦缺血針灸介入治療的越早越能減少腦缺血對神經(jīng)元的損害。

由于人力、物力、時間等客觀因素的影響,本實驗的時段選擇具有局限性,不能涵蓋腦缺血發(fā)病的整個過程。 IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子在腦缺血的病因和發(fā)病機(jī)制中起重要作用,但其作用卻并不是獨立的,本實驗研究的指標(biāo)尚少,不能全面的揭示腦缺血整個發(fā)病過程中多種炎性因子的表達(dá)及之間的關(guān)系,因此益腎調(diào)督針法對腦缺血后各細(xì)胞因子之間的關(guān)系及各細(xì)胞因子對腦缺血損傷的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 邢成名.缺血性腦血管病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2003：134

[2] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91

[3] 劉楠,陳榮華,鄭安,等.IL-10對大鼠腦缺血保護(hù)作用的研究[J].中國藥學(xué)雜志,2005,40(13)：988-990

[4] 袁紅,宋穎,歐翔,等.電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠 IL-6、IL-10表達(dá)影響的實驗研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(中醫(yī)臨床版),2006,13(4)：18-21

[5] Li HL,Kostulas N,Huang YM,et al.IL-17 and IFN-gamma mRNA expression is increased in the brain and systemically after permanent middle cerebral artery occlusion in therat[J].Neuroimmunol,2001,116(1)：5