由王傲雪教授主持的國家自然科學(xué)基金《甘露聚糖酶參與番茄果實(shí)發(fā)育與成熟的分子調(diào)控研究》通過驗(yàn)收。

主要技術(shù)內(nèi)容：番茄甘露聚糖酶是果實(shí)發(fā)育中的一個細(xì)胞壁降解酶，與果實(shí)軟化有關(guān)。該酶在不同品種之間和不同發(fā)育時期存在失活與激活現(xiàn)象。在一些品種中，該酶失活主要是由于編碼該酶的基因發(fā)生兩個核苷酸刪除突變引起的，而在不同時期該酶失活和激活的原因尚不清楚。課題組通過對不同番茄種質(zhì)資源進(jìn)行活性分析，利用天然的具有酶活和沒有酶活的品種進(jìn)行對比，分析酶活與各性狀之間的關(guān)系。同時，對具有酶活的品種進(jìn)行基因敲除，以進(jìn)一步確定該基因?qū)τ诠麑?shí)發(fā)育與成熟的影響。通過啟動子融合GUS基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，確定該基因的表達(dá)模式，并找出果實(shí)特異表達(dá)順式作用元件。另外，通過細(xì)胞定位以及進(jìn)行蛋白印跡分析等手段，查找該酶在綠色果實(shí)失活的可能原因。本課題望得到可用于果實(shí)特異表達(dá)基因的啟動子，并進(jìn)一步明確該基因的功能和表達(dá)模式，并分析該酶在不同時期失活與激活的原因，以為番茄果實(shí)成熟調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

番茄甘露聚糖酶是果實(shí)發(fā)育中的一個細(xì)胞壁降解酶，可能與果實(shí)軟化有關(guān)。為了闡明該酶在果實(shí)發(fā)育中的角色，本研究檢測了該酶在不同品種之間和不同發(fā)育時期的甘露聚糖酶活性，發(fā)現(xiàn)該酶與番茄果實(shí)硬度直接相關(guān)。同時，本研究分離了該基因的啟動子，并通過啟動子融合GUS基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)合RT-PCR和蛋白印跡結(jié)果，確定了該基因的表達(dá)模式，并發(fā)現(xiàn)該基因啟動子中果實(shí)特異表達(dá)順式作用元件存在200-300bp之間。另外，本研究還通過亞細(xì)胞定位、蛋白組化、原核表達(dá)以及綠色果實(shí)抑制物質(zhì)分析等手段，推斷該酶在綠色果實(shí)失活的原因是由于小分子抑制物質(zhì)引起的。此外，本研究還對具有酶活的品種通過RNAi和反義RNA兩種方法抑制甘露聚糖酶基因的表達(dá)，研究證明基因表達(dá)抑制效果與基因拷貝數(shù)無關(guān)，RNAi方法抑制效果要好于反義RNA方法。在被抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中，硬度在轉(zhuǎn)色期得到了提高，但是在紅色果實(shí)期果實(shí)硬度與對照相似，說明該基因在果實(shí)軟化充當(dāng)一個角色，但卻不足以阻止果實(shí)的軟化。本研究明確甘露聚糖酶基因在果實(shí)中的功能和表達(dá)模式，并分析了該酶在綠色果實(shí)失活的原因，為番茄果實(shí)成熟和軟化機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。