銀屑病皮損中VEGF、bFGF的表達(dá)及與微血管密度的相關(guān)性研究

楊海龍，栗玉珍，黨 林

· 論 著 ·

銀屑病皮損中VEGF、bFGF的表達(dá)及與微血管密度的相關(guān)性研究

楊海龍，栗玉珍，黨 林

目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 在銀屑病患者皮損血管生成機(jī)制中的作用。方法采用免疫組化法檢測(cè)尋常型銀屑病患者皮損處VEGF、bFGF及微血管密度（MVD）的表達(dá)情況，并與正常皮膚進(jìn)行比較分析。結(jié)果尋常型銀屑病患者皮損處VEGF、bFGF的表達(dá)及MVD值明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），VEGF與bFGF在銀屑病患者皮損中的表達(dá)差異有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論VEGF及bFGF可能引起銀屑病患者皮損處血管增生，VEGF與bFGF在銀屑病微血管增生過(guò)程中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用且具有協(xié)同促進(jìn)性。

銀屑??；血管生成；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；微血管密度

[J Pract Dermatol, 2010, 3(2):65-68]

銀屑病皮損處最先發(fā)生的病理改變是血管的分布和形成異常[1]，作為一種與血管生成相關(guān)的疾病，對(duì)銀屑病的血管生成機(jī)制的研究現(xiàn)已成熱點(diǎn)，特別是一些血管生成相關(guān)因子日益受到重視。而對(duì)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）二者在銀屑病發(fā)病中的共同作用機(jī)制，目前卻少有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)以尋常型進(jìn)行期銀屑病患者及正常人皮膚為研究對(duì)象，采用免疫組化方法，觀察其皮損處VEGF及bFGF的表達(dá)情況，并對(duì)二者與銀屑病皮損處的微血管異常增生的關(guān)系進(jìn)行比較分析，探討VEGF及bFGF在銀屑病皮損處的微血管異常中發(fā)揮作用的情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

尋常型進(jìn)行期銀屑病患者28例，來(lái)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院皮膚科，其中男15例，女13例；年齡范圍15～65歲，平均42.1歲；病程6個(gè)月～20年，平均4.2年；皮損面積6%～40%。符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①兩周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、維A酸類(lèi)藥物局部治療者；②八周內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑者；③無(wú)其他系統(tǒng)性疾病及免疫功能缺陷者?；顧z取材0.6cm×1.0cm大小皮損，軀干15例，上肢5例，下肢8例。

15例對(duì)照組正常人皮膚來(lái)自哈醫(yī)大二院整形美容科門(mén)診手術(shù)室，其中游離植皮修復(fù)術(shù)6例（腹部4例，下肢2例），下瞼松弛整形術(shù)4例，面部除皺術(shù)5例，入選者均排除全身系統(tǒng)性疾病。

所有標(biāo)本經(jīng)固定、包埋后，3μm切片，取一張做蘇木素-伊紅染色，備普通病理用。

1.2 主要試劑

抗VEGF抗體（兔抗人單克隆抗體，工作液），抗CD34抗體（鼠抗人單克隆抗體，工作液），免疫組化通用型兩步法檢測(cè)試劑盒PV6000，均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，抗bFGF抗體（兔抗人多克隆抗體，1: 200）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化兩步法（PicTure?）按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

VEGF和bFGF 細(xì)胞有棕黃色顆粒視為染色陽(yáng)性。采用半定量計(jì)分法判定[2]。按著色程度評(píng)分，無(wú)著色=0，淺黃色=1，棕黃色=2，棕褐色=3。按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分，＜20%=0，20%～50%=1，50%～80%=2，＞80%=3。按以上2項(xiàng)指標(biāo)的積分和分為4級(jí)，（-）為0～1分，（+）為2分，（++）為3～4分，（+++）為5～6分。

CD34與MVD計(jì)數(shù) CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，陽(yáng)性者被染成棕色。MVD的測(cè)定參考Weidner等[3]方法進(jìn)行，即先在低倍鏡（100×）下掃視整片，尋找高密度血管區(qū)，確定微血管最密集的3個(gè)視野，然后在高倍鏡（400×）下計(jì)數(shù)每一個(gè)視野下的微血管數(shù)目。取3個(gè)視野計(jì)數(shù)結(jié)果的均數(shù)為該切片的微血管密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0/PC軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，VEGF、bFGF結(jié)果采用等級(jí)資料比較的秩和檢驗(yàn)，CD34采用小樣本t 檢驗(yàn)，VEGF、bFGF及CD34間表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)及Kendall等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF的表達(dá)

VEGF在銀屑病患者皮損中主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿，為細(xì)胞內(nèi)顆粒狀棕黃色染色，VEGF表達(dá)幾乎遍布表皮全層，但以棘層染色最強(qiáng)，基底層細(xì)胞染色明顯減弱或不染色，真皮淺層浸潤(rùn)的部分炎癥細(xì)胞胞漿內(nèi)亦可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)。血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)少量表達(dá)（圖1）。在正常人皮膚中VEGF亦有表達(dá)，但表達(dá)弱，表皮層以基底層及棘層細(xì)胞為主（圖2），結(jié)果顯示，VEGF在銀屑病中的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u =28，P＜0.01）。

2.2 bFGF的表達(dá)

bFGF在銀屑病患者皮損中主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞漿，定位于表皮基底層和棘層下部，為棕黃色或黃色，真皮少量表達(dá)于真皮淺層的血管，位于血管壁和血管周?chē)瑸辄S色或淡黃色。毛囊、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亦有不規(guī)則表達(dá)（圖3）。正常人皮膚中bFGF表達(dá)于表皮的基底層，黃色或淡黃色，真皮表達(dá)位置與銀屑病組一致，呈弱表達(dá)（圖4），bFGF在銀屑病中的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u=103，P＜0.01）。

2.3 CD34的表達(dá)

CD34 陽(yáng)性染色表達(dá)位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，形成條狀或環(huán)狀，呈彌漫分布，在正常對(duì)照組及銀屑病患者的皮損真皮層血管內(nèi)皮細(xì)胞均有CD34 表達(dá)（圖5，6），銀屑病患者M(jìn)VD 計(jì)數(shù)（22.02±5.57）顯著高于正常對(duì)照組MVD計(jì)數(shù)（4.62±2.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（t =14.420，P＜0.01）。

2.4 相關(guān)性分析

VEGF與bFGF在銀屑病患者皮損中的表達(dá)差異有相關(guān)性（r =0.4，P＜0.05）（表1），VEGF與MVD差異有相關(guān)性（r =0.346，P＜0.05）， bFGF與MVD差異有顯著相關(guān)性（r = 0.434，P＜0.01）（表2）。

表1 銀屑病皮損VEGF與bFGF的相關(guān)性分析

表2 銀屑病皮損VEGF、bFGF的表達(dá)與MVD的相關(guān)性

3 討論

VEGF是一種作用最強(qiáng)，且唯一能特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，它不僅可以促進(jìn)真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，還可以增加血管通透性，并對(duì)炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞有化學(xué)趨化作用。筆者的實(shí)驗(yàn)表明，銀屑病皮損處VEGF表達(dá)明顯增加，這與Detmar等[4]報(bào)道相一致。在正常人皮膚中也有一定量的VEGF表達(dá)，主要分布于表皮基底層和毛囊外毛根鞘部位，此處的VEGF可能以旁分泌作用調(diào)節(jié)皮膚血管的自身平衡[4]。最近有報(bào)道[5]將編碼VEGF的基因轉(zhuǎn)入小鼠皮膚可致銀屑病樣改變，包括特征性血管變化、表皮變化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這進(jìn)一步表明VEGF 可能在銀屑病發(fā)病過(guò)程中起重要作用。

圖1 銀屑病皮損處VEGF的表達(dá)

圖2 正常皮膚VEGF的表達(dá)

圖3 銀屑病皮損處bFGF的表達(dá)

圖4 正常皮膚bFGF的表達(dá)

圖5 銀屑病皮損處CD34的表達(dá)

體外培養(yǎng)表明正常皮膚中主要是角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF，而銀屑病的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均可分泌大量的VEGF。有報(bào)道，由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的VEGF對(duì)于銀屑病皮損部血管異常起著決定作用，可加重銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)銀屑病的病理過(guò)程，且進(jìn)行期皮損的真皮乳頭層微血管內(nèi)皮細(xì)胞上可見(jiàn)有VEGF受體KDR和FLT-1 的表達(dá)，而正常皮膚則無(wú)[6,7]。

bFGF是一種能促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成的多功能細(xì)胞因子，現(xiàn)已證明其在體內(nèi)外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有促分裂和趨化作用，能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和纖維蛋白酶，降解基底膜，并誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞向三維膠原基質(zhì)中遷移，形成毛細(xì)血管樣腔狀結(jié)構(gòu)[8,9]。

在多種腫瘤細(xì)胞中，bFGF常呈過(guò)度表達(dá), 參與促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖和血管生成的病理過(guò)程[10]。在表皮腫瘤、脂溢性角化病、基底細(xì)胞上皮瘤和鱗狀細(xì)胞癌等中均可見(jiàn)bFGF蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，bFGF在銀屑病表皮中陽(yáng)性表達(dá)程度顯著高于正常人皮膚表皮層，基底層最明顯，這一研究結(jié)果與Arbiser等[11]用免疫組化法檢測(cè)bFGF在銀屑病表皮的表達(dá)定位基本一致。基底層是正常人皮膚組織中增殖和代謝最活躍的部位，bFGF在此部位的高表達(dá)表明其可能對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化起一定作用。bFGF不僅高表達(dá)于銀屑病皮損表皮，亦少量表達(dá)于真皮異常增生的微血管，提示bFGF高表達(dá)在銀屑病中的作用可能與它們?cè)谀[瘤與新生血管中的作用一樣,都促進(jìn)了血管增生。

Bequet-Romero等[12]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)bFGF對(duì)VEGF的表達(dá)具有調(diào)控作用，而本研究中，銀屑病皮損處二者表達(dá)相關(guān)性也提示bFGF可能是通過(guò)上調(diào)VEGF及其受體的表達(dá)而間接促進(jìn)了血管生成，這說(shuō)明VEGF與bFGF在銀屑病中促血管生成方面能起一定的協(xié)同作用。但VEGF與bFGF在銀屑病中促血管生成方面發(fā)揮協(xié)同作用的具體調(diào)控機(jī)制及與其它血管生成相關(guān)因子間的相互作用還有待于進(jìn)一步深入研究探討。

[1] Goodfield M, Hull SM, Holland D, et al. Investigations of the "active" edge of plaque psoriasis:vascular proliferation precedes changes in epidermal keratin [J]. Br J Dermatol, 1994, 131(6):808-813.

[2] Hao XP, Willis JE, Pretlow TG, et al. Loss of fragile histidine triad expression in colorectal carcinomas and premalignant lesions [J]. Cancer Res, 2000, 60(1):18-21.

[3] Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma [J]. N Engl J Med, 1991, 324(1):1-8.

[4] Detmar M, Brown LF, Claffey KP, et al. Overexpression of vascular permeabitiy factor/vascular endothelial growth factor and its receptors in psoriasis [J]. J Exp Med, 1994, 180(3):1141-1146. [5] Xia YP, Li B, Hylton D, et al. Transgenic delivery of VEGF to mouse skin leads to an inflammatory condition resembling human psoriasis [J]. Blood, 2003, 102(1):161-168.

[6] Bhushan M, Mc laughlin B, Weiss JB, et al. Levels of endothelial cell stimulating angiogenesis factor and vascular endothelial growth factor are elevated in psoriasis [J]. Br J Dermatol, 1999, 141(6):1054-1060.

[7] 陳積愫, 鄭敏. 尋常型銀屑病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及單核細(xì)胞趨化因子-1表達(dá)的研究 [J]. 中華皮膚科雜志, 2002, 35(2):11l-113.

[8] Seandel M, Noack-Kunnmann k, Zhu D, et al. Growth factor -induced angiogenesis in vivo requires specific cleavage of fibrillar type Ⅰcollagen [J]. Blood, 2001, 97(8):2323-2332.

[9] Zhang X, Ibrahimi OA, Olsen SK, et al. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. The complete mammalian FGF family [J]. J Biol Chem, 2006, 281(23):15694-15700.

[10] 何玲, 竇肇華. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2002, 22(1):80-82.

[11] Arbiser JL, Byers HR, CohenC, et al. Altered basic fibroblast growth factor expression in common epidermal neoplasms:examination with in situ hybridization and immunohistochemistry [J]. J Am Acad Dermatol,2000, 42(6):973-977.

[12] Bequet-Romero M, López-Ocejo O. Angiogenesis modulators expression in culture cell lines positives for HPV-16 oncoproteins [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000,277(1): 55-61.

Study on correlation between expression of VEGF, bFGF and MVD in the psoriatic lesions

YANG Hai-long，LI Yu-zhen，DANG Lin
Department of Dermatology, The Fifth Affliated Hospital of Harbin University, Daqing 163316, China

ObjectiveTo investigate the effect of VEGF and bFGF in the mechanism of the angiogenesis of psoriasis vulgaris.MethodsThe expression of VEGF, bFGF and MVD from samples of psoriasis vulgaris tissue was examined by immunohistochemistry. Then, compared with those of skin tissue from healthy individuals.ResultsThe expression of VEGF, bFGF and MVD in psoriasis vulgaris tissue was significantly higher than those in the normal group (P＜0.05). There was a significant correlation between the expression of VEGF and that of bFGF (P＜0.05).ConclusionVEGF and bFGF possibly may cause angiogenesis in psoriatic lesion. VEGF and bFGF play positive role in regulating and facilitating synergy in the process of proliferation of microvessels in psoriasis.

Psoriasis；Angiogenesis；Vascular endothelial growth factor；Basic fibroblast growth factor；Microvessel density

R758.63

A

1674-1293(2010)02-0065-04

楊海龍

2010-03-06

2010-04-05）

（本文編輯 敖俊紅）

163316 大慶，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬五院皮膚科（楊海龍）；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院皮膚科（栗玉珍，黨林）

楊海龍，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：銀屑病

E-mail: yhlyhl1976@163.com

作者簡(jiǎn)介：栗玉珍，E-mail: liyuzhen@medmail.com.cn