唐兆前,李 力,張 瑋,王 琪,唐步堅(jiān)

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,南寧 530021)

卵巢癌化療藥物耐藥現(xiàn)象成為影響其療效的主要原因。研究發(fā)現(xiàn),在惡性腫瘤中表觀遺傳基因?qū)τ谡{(diào)控原發(fā)性以及獲得性耐藥都起重要作用[1],其中 DNA甲基化是基因突變及缺失之外腫瘤抑制基因失活的第三種機(jī)制。2008年 7月 ～2010年 2月,我們觀察了卵巢癌卡鉑耐藥細(xì)胞系(SKOV3-CB)中各抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),以探討其與卵巢癌卡鉑耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 RNA抽提試劑 Trizol,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid Fiststrand cDNA Synthesis Kit,DNAzol基因組 DNA快速提取試劑盒,Cp Genome DNA修飾試劑盒,凝膠成像系統(tǒng) quality-one,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀,卵巢癌卡鉑耐藥細(xì)胞系 SKOV3-CB、親本細(xì)胞系SKOV3及其表達(dá)譜芯片。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌卡鉑耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因的篩選

應(yīng)用分子生物信息學(xué)方法,在“www.ncbi.nlm.nih.gov”網(wǎng)站,查找 “tumor suppressor gene”,篩選卵巢癌卡鉑耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因,共 13個(gè)腫瘤抑制基因(VHL、COPS2、NOL7、GGNBP2、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8)表達(dá)下調(diào)。

1.2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因表達(dá)的檢測(cè) 待 SKOV3-CB、SKOV3細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的70%～80%時(shí),獲取細(xì)胞 1×107～5×107個(gè),移入1.5 ml離心管中。根據(jù) Trizol法提取細(xì)胞總 RNA并行凝膠電泳,用紫外分光光度儀檢測(cè)抽提總 RNA的質(zhì)量和濃度。要求 A260/A280為 1.8～2.0,并計(jì)算RNA含量。cDNA合成參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。RT-PCR反應(yīng):應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer 5.0設(shè)計(jì)引物,并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。在DNA Engine Opticon TM連續(xù)熒光檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。陰性對(duì)照以無 RNA酶的水代替 cDNA模板。每例樣品及對(duì)照均設(shè) 3個(gè)平行復(fù)孔,取平均值。反應(yīng)結(jié)束后,由軟件自動(dòng)得出熒光反應(yīng)曲線以及每個(gè)標(biāo)本反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率及 CT值。SKOV3-CB相對(duì)于 SKOV3表達(dá)的計(jì)算公式:XN,q/XN,cb=

1.2.3 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè) 登陸“http://genome.ucsc.edu/”查找出各基因的啟動(dòng)子,應(yīng)用 Methyl Primer Express Software Version 1.0軟件,對(duì)所篩選基因進(jìn)行 CpG島評(píng)估,設(shè)計(jì)出 8個(gè)基因(VHL,COPS2、NOL7、RBL1、PARG1、PERP、DNAJA3)的引物,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用甲基化特異性 PCR(MS-PCR)法檢測(cè) SKOV3-CB、SKOV3細(xì)胞 8個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因表達(dá)情況 與 SKOV3耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因表達(dá)比較,除 GGNBP2基因外,其余 12個(gè)基因 VHL、COPS2、NOL7、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8 均在 SKOV3-CB中表達(dá)下調(diào),下調(diào)倍數(shù)分別為 65.24、1.30、2.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.00、23.98。

2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) MS-PCR結(jié)果顯示,ING1、NAJA3、VHL甲基化引物均能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物,未甲基化引物均不能擴(kuò)增出產(chǎn)物；COPS2、PERP甲基化引物均不能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物,未甲基化引物均能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物；PARG1,、NOL7、RBL1甲基化引物與未甲基化引物均能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物。

3 討論

基因甲基化是一種可遺傳的、酶誘導(dǎo)的、對(duì)基因結(jié)構(gòu)的特殊堿基序列起穩(wěn)定作用、負(fù)責(zé)編碼正?；虻幕瘜W(xué)修飾。即在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTS)作用下將一個(gè)甲基集團(tuán)加到 DNA分子核苷酸堿基上的生化過程[3]。人類 DNA甲基化 90%發(fā)在 CpG二核苷酸,基因組中 Cp G密集的區(qū)域稱作 CpG島,多分布于 5′和 3′非編碼區(qū)。盡管全基因組中 CpG島甲基化是高發(fā)的,但在活化基因的 5′非編碼區(qū)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi),CpG島都呈去甲基化狀態(tài)[4]。如果啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化,將直接或間抑制轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致下游基因表達(dá)沉默。因此,啟動(dòng)子區(qū) CpG島甲基化是抑制基因表達(dá)的重要機(jī)制。

腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū) CpG島頻繁發(fā)生異常的甲基化,導(dǎo)致基因沉默或表達(dá)下調(diào)[5]可能是卵巢癌患者化療耐藥的重要原因[6]。其甲基化狀態(tài)可作為反映藥物療效和抗藥性的一個(gè)有用的指標(biāo)[7]。因而,探討其可能的甲基化機(jī)制,對(duì)卵巢癌卡鉑耐藥的研究有重要意義。即便沒有甲基化機(jī)制參與,也可為進(jìn)一步探討其他的可能機(jī)制提供參考。我們通過卵巢癌卡鉑耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因中 ,VHL、COPS2、NOL7、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、 ING1、 RARRES3、RBBP8共 12個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這表明多腫瘤抑制基因參與卵巢癌卡鉑耐藥。通過對(duì)下調(diào)基因啟動(dòng)子區(qū) CpG島評(píng)估,發(fā)現(xiàn)有 8個(gè)基因 (ING1、PERP、RBL1、COPS2、VHL、PARG1、 NOL7、DANJA3)能夠設(shè)計(jì)出甲基化引物進(jìn)行 MSP。MSP結(jié)果顯示,在卵巢癌卡鉑耐藥細(xì)胞系與其親本細(xì)胞系中,ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物,未甲基化引物均不能擴(kuò)增出產(chǎn)物；COPS2、PERP甲基化引物均不能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物,未甲基化引物均能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物；在兩種細(xì)胞系中 PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物與未甲基化引物均能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物。換言之,本研究沒有發(fā)現(xiàn)以上兩種細(xì)胞系各相關(guān)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)有差異甲基化。因此,卵巢癌卡鉑耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)無超甲基化,甲基化機(jī)制不是引起卵巢癌卡鉑耐藥相關(guān)腫瘤抑制基因表達(dá)下調(diào)的原因。

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