河北省石家莊市第一人民醫(yī)院 （石家莊 050011）

羊淑平 馬小寧 韓 芳△ 李 昌△△ 高 瑋△△ 韓 雪△△ 李美錫△△△

消瘀化痰方系經(jīng)過多年臨床篩選出的治療非酒精性脂肪肝 （NAFLD）的效方,既往藥效學(xué)實驗已證實消瘀化痰方具有顯著的調(diào)節(jié)血脂和抗脂肪肝作用。[1]本研究采用高脂飲食建立 NAFLD模型,觀察大鼠血清腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和白細(xì)胞介素 -6（IL-6）的含量變化,探討消瘀化痰方治療 NAFLD的作用機制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性 SD大鼠 50只,體重 180～200 g,由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供,合格證號:SCXC（鄂）2004-007。

1.2 藥物及試劑 消瘀化痰方的組成與制備:消瘀化痰飲由澤瀉、丹參、海藻、生黃芪、制半夏、生大黃、郁金、決明子、生山楂、柴胡、炒白術(shù)組成,以上藥物先用乙醇提取,揮發(fā)去酒精,然后將全部藥渣加水適量,普通方法煎煮,將提取液與煎煮液混合,濃縮成所需濃度。東寶甘泰片:通化東寶藥業(yè)股份有限公司出品,批號為H22024764。實驗時用 0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和白細(xì)胞介素 -6（IL-6）試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所。

1.3 主要儀器 FJ-2020型 γ射線免疫計數(shù)器（國營 262廠）,MSE-25型高速冷凍離心機 （上海安亭科學(xué)儀器廠）,LAUDA-C3型循環(huán)恒溫水浴箱 （泰克儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組與造模 50只健康雄性 SD大鼠,飼養(yǎng)于 18℃～22℃明暗各 12 h的清潔級動物實驗室內(nèi),正常喂養(yǎng) 1周后,隨機分為 5組,即:正常對照組 （簡稱正常組）、模型對照組 （簡稱模型組）、消瘀化痰方高、低劑量組 （簡稱高、低劑量組）、陽性藥 （東寶肝泰）對照組 （簡稱對照組）。動物造模參照文獻(xiàn)[2]喂飼高脂飼料,高脂飼料由1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和 88%基礎(chǔ)飼料制成。除正常組喂飼普通飼料外,其余各組均給予高脂飼料,連續(xù) 9周。

2.2 給藥方法及標(biāo)本處理 大鼠造模的同時,各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃,給藥劑量按藥理實驗方法學(xué)計算,消瘀化痰方高、低劑量組分別按43.34 g/kg、21.67 g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服,對照組按 0.9 g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服,正常組和模型組灌服生理鹽水。各組 1次/d灌胃,每次用藥體積均按 1 mL/100 g計算。實驗 9周末,于最后 1次給藥禁食 12 h后斷頭取血,迅速將血樣低溫離心,分離血清,密封,-20℃冷存待檢。在肝臟最大葉距邊緣 1 cm處取肝組織 0.5 cm×0.5 cm浸泡于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察肝組織形態(tài)變化。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 肝組織形態(tài)學(xué)觀察:取大鼠用 4%的多聚甲醛固定的肝組織,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

2.3.2 TNF-α和 IL-6的測定:均采用放射免疫法,嚴(yán)格按試劑盒說明書檢測。

3 結(jié)果

3.1 肝組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡下可見:正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,中央靜脈大而壁薄,肝細(xì)胞排列成肝索,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,細(xì)胞呈多邊形。模型組大鼠肝細(xì)胞中度細(xì)胞水腫,少量的肝細(xì)胞壞死,多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡 （脂肪變性）,重度變性者,脂滴空泡融合,呈現(xiàn)中至重度脂肪變性,但未見明顯的纖維化改變。各治療組動物肝小葉和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰,高、低劑量組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴空泡基本消失,對照組中少量的肝細(xì)胞內(nèi)仍有脂滴空泡,并有輕度的細(xì)胞水腫。

3.2 消瘀化痰方對 NAFLD大鼠血清 TNF-α和IL-6含量的影響 結(jié)果顯示,模型組大鼠的血清TNF-α和 IL-6的含量較正常組明顯升高 （P＜0.01）,經(jīng)藥物治療后,各用藥組血清 TNF-α和 IL-6的含量均低于模型組 （P＜0.05或 P＜0.01）;高、低劑量組大鼠血清 TNF-α和 IL-6的含量均低于對照組 （P＜0.05）,高、低劑量組之間差異無顯著性 （P＞0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-6測定結(jié)果比較 （±s,n=10）

表1 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-6測定結(jié)果比較 （±s,n=10）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與對照組比較,△P＜0.05

組別 TNF-α（ng/m L） IL-6（ng/mL）正 常 組 0.73±0.11** 16.7±2.16**模 型 組 1.41±0.18 22.4±3.92高劑量組 0.82±0.13**△ 17.6±2.85**△低劑量組 0.86±0.15**△ 17.2±2.77**△對 照 組 1.16±0.21* 19.4±3.53*

4 討論

課題組人員經(jīng)多年臨床觀察認(rèn)為 NAFLD多由飲食失節(jié),恣食肥甘厚味,損傷脾胃,使其運化失常,釀生痰濁,聚集體內(nèi),痰阻氣滯,肝失調(diào)達(dá),血脈瘀阻,痰瘀結(jié)于脅下,形成本病。故痰瘀互結(jié)、肝脾失調(diào)為其主要病機,消痰化瘀、健脾疏肝為其有效治法。因此,精心篩選相關(guān)藥物組成消瘀化痰飲,經(jīng)臨床應(yīng)用療效滿意。方中選用澤瀉、制半夏、海藻除水濕、消痰濁;丹參、郁金活血通絡(luò),祛肝經(jīng)之瘀,增強肝臟血運;生大黃通腑導(dǎo)滯,降濁祛脂,與澤瀉配用,分流疏導(dǎo),使邪有去路;生山楂祛瘀消積;柴胡、決明子疏肝利膽,清肝經(jīng)郁熱;生黃芪、炒白術(shù)補氣健脾,以助痰瘀的運除,而且也體現(xiàn)了 “見肝之病,當(dāng)先實脾”的治療法則。諸藥合用則清降痰濁瘀積,調(diào)節(jié)肝脾功能,從而達(dá)到抗脂肪肝的目的。

高脂飲食所誘發(fā)的血漿低密度脂蛋白、甘油三酯和游離脂肪酸含量增高,以及伴隨的高密度脂蛋白水平下降和腸源性內(nèi)毒素血癥,使肝臟枯否氏細(xì)胞聚集、增生和激活,枯否氏細(xì)胞可分泌 TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子,導(dǎo)致生物膜的損傷。研究表明,肝臟枯否氏細(xì)胞過量分泌 TNF-α、IL-6等因子是引起肝細(xì)胞壞死的重要介質(zhì)。[2-4]TNF通過與細(xì)胞表面的 TNF受體結(jié)合而起作用,肝細(xì)胞的 TNF受體具有高親和力、低容量等特點,故對低濃度的 TNF-α即可發(fā)生強烈反應(yīng),另外,TNF-α是脂蛋白酶的強力抑制劑,高濃度的 TNF-α可減少外周組織脂肪分解,并促進肝細(xì)胞甘油三酯的合成及聚集。TNF-α還可誘導(dǎo)IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,共同參與肝損害,另外還可引起中性粒細(xì)胞趨化,進而導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng),并通過脂質(zhì)過氧化使細(xì)胞受損,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。[5]

本項研究結(jié)果顯示,采用高脂飲食復(fù)制的NAFLD動物模型大鼠,由于實驗過程中長期大量進食高脂肪、高膽固醇飲食,游離脂肪酸 （FFA）被肝臟攝取量也隨之增多而蓄積,FFA是具有高度細(xì)胞毒性的兩性分子,FFA作用于肝細(xì)胞,可導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體腫脹和通透性增加、肝細(xì)胞變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤,誘發(fā)非酒精性脂肪性肝炎,內(nèi)毒素血癥可激活肝細(xì)胞或/和枯否細(xì)胞,促使其分泌 TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子,導(dǎo)致生物膜的損傷。經(jīng)藥物干預(yù)后,治療各組血 TNF-α和 IL-6的含量均低于模型組 （P＜0.05或 P＜0.01）;高、低劑量組低于陽性藥對照組 （P＜0.05）;而高、低劑量組之間和 TNF-α和 IL-6的含量未見明顯差異 （P＞0.05）,說明各用藥組均有抑制枯否細(xì)胞過度活化、降低血清 TNF-α和 IL-6的含量,減少炎性細(xì)胞浸潤的作用,而消瘀化痰方的保護肝臟作用優(yōu)于陽性對照藥。

綜上所述,經(jīng)動物實驗證實,TNF-α和 IL-6在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,TNF-α和 IL-6合成與釋放過多介導(dǎo)了肝損傷的發(fā)病過程。因此,檢測血清中血清 TNF-α和 IL-6的含量高低可以作為 NAFLD臨床診斷的重要參考指標(biāo)之一。另外,消瘀化痰方可顯著降低血清血清 TNF-α和 IL-6含量,防止其對肝臟的進一步損害,此可作為消瘀化痰方治療NAFLD的作用機制之一。

[1] 苗卉,魏翠萍,張一盺,等.消瘀化痰飲對非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝和肝組織形態(tài)學(xué)的影響 [J].河北中醫(yī)藥報,2007,22（2）:3-5

[2] 陳賢明,馬學(xué)惠,許瑞齡,等.酒精刺激對枯否氏細(xì)胞清除LPS功能的影響 [J].中國病理生理雜志,1998,14（4）:389

[3] 任紅,張定風(fēng),賈小平,等.病毒性肝炎腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素 6的研究 [J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1989,5（3）:264

[4]McClain CJ,Barve S,Dohn L,et al.Cytokines in alcoholic liver disease[J].Semin Liver Dis,1999,19:205

[5] 范建高,曾民德.脂肪肝 [M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,2000.69

（2009-12-30 收稿）