蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院 邱 燕 蔡春芳 代小芳 葉元土＊ 尹曉靜 張 俊 譚芳芳

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和抗生素的廣泛應(yīng)用，抗生素的缺點(diǎn)逐漸暴露出來(lái)，抗生素濫用不但起不到防病增產(chǎn)的目的，反而造成動(dòng)物腸道內(nèi)致病菌的抗藥性以及水產(chǎn)品中的藥物殘留問(wèn)題，進(jìn)而影響人類的身體健康。微生態(tài)制劑作為可替代抗生素的一種飼料添加劑已經(jīng)引起人們的廣泛重視（Hwang等，2008）。其中，枯草芽孢桿菌以其抗菌性能好、穩(wěn)定性強(qiáng)及對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的益生作用受到廣大研究者的青睞。本試驗(yàn)旨在探討枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響，為枯草芽孢桿菌在草魚(yú)飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 芽孢桿菌屬：枯草芽孢桿菌，活菌數(shù)達(dá)到2.0×109CFU/g。草魚(yú)：由無(wú)錫宜興養(yǎng)殖廠提供，平均體重（69.51±6.29）g，共 240 尾。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧組成 試驗(yàn)草魚(yú)隨機(jī)分為5組，以基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組；在基礎(chǔ)飼料中分別添加 1000、1500、2000 mg/kg 和 2500 mg/kg 的枯草芽孢桿菌作為4個(gè)試驗(yàn)組，共5個(gè)組。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16尾魚(yú)，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料經(jīng)微粉碎后過(guò)40目篩，混合均勻后用小型顆粒飼料機(jī)加工成直徑1.5 mm的顆粒飼料備用，飼料加工過(guò)程中溫度65～70℃，持續(xù)時(shí)間約1 min。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 在50畝的池塘中設(shè)置網(wǎng)箱進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，網(wǎng)箱規(guī)格為1 m×1 m×1.5 m，本試驗(yàn)共15個(gè)網(wǎng)箱。試驗(yàn)魚(yú)經(jīng)過(guò)2周的養(yǎng)殖馴化后再進(jìn)行分組。飼料投喂每天3次，投喂量為體重的2%～3%。試驗(yàn)時(shí)間為2008年8～10月，飼養(yǎng)期間水質(zhì)條件為：水溫（28.0 ± 3.0）℃，DO ＞ 8.0 mg/L，pH＜8.3，亞硝酸鹽＜0.01 mg/L，硫化物＜0.05 mg/L。正試期70 d。

1.4 樣品采集和分析 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h后測(cè)定每箱魚(yú)的總體重和尾數(shù)，計(jì)算成活率、飼料系數(shù)、特定生長(zhǎng)率。解剖試驗(yàn)魚(yú)，取出內(nèi)臟團(tuán)，分離出腸道，剔除表面脂肪組織，分別取中腸1 cm左右的組織1～2塊，縱向剖開(kāi)，使腸黏膜暴露于空氣中，用生理鹽水沖洗3～4次，除去其上所帶有的血液、糞便等雜質(zhì)，制得腸道樣品。

掃描電鏡腸道樣品置于4%戊二醛固定液中，超聲波洗滌10 min，更換固定液再次洗滌，更換固定液保存。制樣時(shí)將其取出，洗滌，適當(dāng)修剪，1%鋨酸固定1 h，0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液洗3次，叔丁醇系列梯度脫水，真空干燥，噴金，S-4700型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察、拍照。

組織切片腸道樣品置于4%中性甲醛中固定、70%乙醇保存。分別經(jīng)濃度為70%、80%、90%、95%以及100%的酒精梯度脫水，并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔點(diǎn)石蠟中。使用KD-2508型切片機(jī)橫向連續(xù)切片，厚度為8 μm，而后展片于清潔的載玻片上。采用H.E染色，中性樹(shù)膠封片。顯微測(cè)量腸道皺襞高度、寬度，黏膜層、肌層、漿膜層厚度，光學(xué)顯微鏡下觀察并采用Nikon COOLPIX4500型相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.5 計(jì)算公式

成活率/%＝（試驗(yàn)?zāi)~(yú)尾數(shù)/試驗(yàn)初魚(yú)尾數(shù)）×100；

特定生長(zhǎng)率/（%/d）＝（ln 末均重－ln 初均重）/飼養(yǎng)天數(shù)×100；

飼料系數(shù)＝每個(gè)網(wǎng)箱投喂飼料總量/每個(gè)網(wǎng)箱魚(yú)體總增重量。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 14.0版統(tǒng)計(jì)軟件中One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan’s多重比較，顯著水平為0.05，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響 見(jiàn)表2。各試驗(yàn)組成活率均為100%，對(duì)照組為98%。在特定生長(zhǎng)率方面：與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組分別增加了 12.77%、22.34%、30.85%和5.32%；其中，枯草芽孢桿菌以2000 mg/kg組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。在飼料系數(shù)方面：與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組分別下降了16.46%、26.16%、31.22%、5.06%，其中2000 mg/kg組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P ＞0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)腸道黏膜形態(tài)的影響

2.2.1 腸道皺襞觀察 結(jié)果見(jiàn)表3，各試驗(yàn)組均高于對(duì)照組，其中1500 mg/kg和2500 mg/kg組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；黏膜層厚度與皺襞高度表現(xiàn)一致。各試驗(yàn)組皺襞寬度、肌層厚度、漿膜層厚度均與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 腸道微絨毛觀察 結(jié)果見(jiàn)表4，除1500 mg/kg組外，其余試驗(yàn)組微絨毛高度均高于對(duì)照組，其中1000 mg/kg和2500 mg/kg組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組微絨毛寬度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），微絨毛密度均高于對(duì)照組（P＞0.05）。

表2 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)成活率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)的影響

表3 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)腸道皺襞的影響μm

表4 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)腸道微絨毛的影響

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌具有顯著提高草魚(yú)生長(zhǎng)性能的作用。各試驗(yàn)組草魚(yú)特定生長(zhǎng)率均比對(duì)照組增加5%以上，其中2000 mg/kg組顯著高于對(duì)照組，增加了30.85%；各試驗(yàn)組飼料系數(shù)與對(duì)照組相比，下降了5%以上，其中2000 mg/kg組顯著低于對(duì)照組，下降了31.22%。這與劉云高（1994）、王子彥等（1994）報(bào)道結(jié)果一致。

本試驗(yàn)各試驗(yàn)組腸道皺襞高度均高于對(duì)照組，其中1500 mg/kg和2500 mg/kg組皺襞高度顯著高于對(duì)照組。腸道皺襞的高度增加，能夠增大腸內(nèi)表面積從而使腸道的吸收面積、腸道與食物的接觸面積增大，因而消化功能增強(qiáng)。

微絨毛是腸道的特有結(jié)構(gòu)，它的高矮和密度大小直接影響腸道的吸收面積。馬力等（1989）研究表明，腸黏膜上皮游離端紋狀緣（微絨毛）含有多種消化酶，具有消化吸收的雙重作用。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)草魚(yú)腸道掃描電鏡的觀察可知，各試驗(yàn)組微絨毛高度均高于對(duì)照組，其中1000 mg/kg和2500 mg/kg組顯著高于對(duì)照組，各試驗(yàn)組微絨毛寬度均顯著高于對(duì)照組，各試驗(yàn)組微絨毛密度均高于對(duì)照組，表明枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)草魚(yú)腸道微絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育，通過(guò)顯著增加微絨毛高度、寬度，并增加其密度來(lái)增加腸道的吸收面積，增強(qiáng)腸道的消化吸收能力，提高飼料利用率，從而促進(jìn)草魚(yú)的生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)枯草芽孢桿菌添加到2500 mg/kg，特定生長(zhǎng)率有下降的趨勢(shì)且飼料系數(shù)有所增加，可能由于過(guò)量添加枯草芽孢桿菌導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)菌群比例失調(diào)，生產(chǎn)性能下降。此外，芽孢桿菌產(chǎn)生過(guò)量的酶也有可能抑制動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源酶的活性，降低內(nèi)源酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解作用，從而降低了生長(zhǎng)性能，這與王愛(ài)民（2003）、劉迎春（1996）報(bào)道在魚(yú)類飼料中添加一定的外源酶能促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)，過(guò)量的外源酶降低魚(yú)體的生長(zhǎng)性能的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

適量添加枯草芽孢桿菌能夠通過(guò)改善草魚(yú)腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而促進(jìn)草魚(yú)生長(zhǎng)。

[1]劉云高，楊明高，胡未一，等.魚(yú)用微生物飼料添加劑（8801）對(duì)鯉魚(yú)促生長(zhǎng)試驗(yàn)[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，增刊：650～653.

[2]劉迎春.飼用復(fù)合酶對(duì)產(chǎn)蛋雞低蛋白飼糧氨基酸可利用率的影響：[碩士學(xué)位論文][D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，1996.

[3] 馬力.掃描電鏡研究露斯塔野紋的腸粘膜[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1989，13（2）：177～180.

[4]王愛(ài)民.外源酶對(duì)內(nèi)源酶活性、腸道組織及生產(chǎn)性能的影響研究：[碩士學(xué)位論文][D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[5]王子彥，何明清，陳孝躍，等.魚(yú)用微生物飼料添加劑在不同營(yíng)養(yǎng)水平下對(duì)魚(yú)的促生長(zhǎng)研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，增刊：658～661.

[6]HwangM H，Kim M H，GebruE，etal.Killing rate curve and combination effects of surfactin C produced from bacillus subtillus complex BC1212 against pathogenic Mycoplasma hyopneumoniae[J].World J Microbi Biot，2008，5：9749 ～ 9752.