武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司 程時軍

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 馬立保＊

鑒于抗生素的使用會帶來畜禽產(chǎn)品藥物殘留、耐藥基因轉(zhuǎn)移到微生物等負(fù)面作用，近年來許多國家開始逐步限制使用飼用抗生素，因此新的、安全高效的飼用抗生素替代品的開發(fā)已是迫在眉睫，早已應(yīng)用于食品及醫(yī)療行業(yè)中的溶菌酶因是蛋白質(zhì)類，具有類似抗生素的作用特點，近年來受到了畜牧行業(yè)的普遍關(guān)注。本試驗以溶菌酶取代飼料中的抗生素添加劑，結(jié)合相關(guān)抗生素的研究方向，探討溶菌酶對肉雞生產(chǎn)性能的影響并簡要探討其機(jī)制，為溶菌酶在飼料工業(yè)中取代抗生素的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及動物 溶菌酶：500000 U/g，由武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司提供，酶活單位定義：在25℃、pH為6.2的條件下，于450 nm處每分鐘引起溶酶小球菌體溶液吸光度下降0.001為1個酶活力單位（U）。

1.2 試驗日糧 參照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 33-2004》配制玉米-豆粕型粉料，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗分組 采用單因子試驗設(shè)計，選擇144只1日齡艾維茵肉雞仔隨機(jī)分4為組，每組6重復(fù)，每重復(fù)6只，公母各半，各處理見表2。

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗肉雞地面平養(yǎng)，自由采食和飲水，試驗分0～3周齡和4～6周齡兩個階段；室內(nèi)溫度按艾維茵飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)控制；在3周齡時以地克珠利飲水防球蟲病；免疫程序：7 d新城疫Lasota+傳染性支氣管炎H120二聯(lián)苗滴鼻、點眼，14 d和21 d IBD飲水。

表1 試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

表2 試驗分組及日糧處理

1.5 測定指標(biāo) 21日齡和42日齡清晨以重復(fù)為單位稱雞活重和余料重量，計算不同階段肉雞平均日采食量、平均日增重及料重比。于42日齡清晨從各處理雞中隨機(jī)選取6只 （每重復(fù)1只），編號稱重后，翅靜脈采血備用測血清新城疫抗體效價；采血后進(jìn)行屠宰，迅速取脾臟保存測細(xì)胞因子；取十二指腸、空腸各2 cm左右，并以棉線結(jié)扎兩端，用酒精棉球消毒各結(jié)扎口，置于冰盒送實驗室超凈臺食糜微生物待測，最后取其胸腺、法氏囊稱重。

1.6 檢測方法

1.6.1 血清新城疫抗體效價 采用血凝抑制法（HI）測定（楊漢春，2003）。

1.6.2 食糜微生物數(shù)量 超凈工作臺中，從腸道分別取0.5 g食糜，加入4.5 mL PBS稀釋液，靜置5 min后，取上清液0.5 mL于4.5 mL稀釋液，依次倍比稀釋到 10-9后，分別從 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9濃度離心管中取 100 μL 于大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌及梭菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。以每平皿菌落數(shù)30～200個為有效，每樣作2平行，取平均數(shù)。菌落數(shù)計數(shù)公式：每g內(nèi)容物菌落數(shù)=lg[（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣毫升數(shù)）/（接種用樣品毫升數(shù)×樣品克數(shù)）]

1.6.3 細(xì)胞因子TNF-α，IL-1 mRNA 用TRIzol提取脾臟RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過RT-PCR檢測細(xì)胞因子TNF-α，IL-1 mRNA設(shè)計引物擴(kuò)增相應(yīng)基因片段 （見表3）。RT-PCR反應(yīng)程序：95℃、2 min，1 個循環(huán)，然后 95 ℃、15 s，56 ℃、30 s，68 ℃、45 s，共35個循環(huán)。

表3 實時定量PCR所用引物

1.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行ONE-WAY ANOVA分析，并以LSD作多重比較。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶對42 d肉雞十二指腸食糜微生物數(shù)量的影響 見表4。從表4可以看出，3個試驗組十二指腸中梭菌總數(shù)分別比對照組極顯著降低了4.03%、2.6%和5.6%（P＜0.01）；與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2極顯著降低了大腸桿菌總數(shù)（P＜0.01）；各處理對十二指腸雙歧桿菌和乳酸桿菌有降低的趨勢，但無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 溶菌酶對42 d肉雞空腸食糜微生物數(shù)量的影響 見表5。從表5可見，與對照組相比，抗生素組極顯著降低了空腸梭菌總數(shù)（P＜0.01），2個溶菌酶處理組顯著降低空腸梭菌總數(shù) （P＜0.05）；與對照組相比，溶菌酶組1顯著降低了空腸大腸桿菌總數(shù)（P＜0.05）；各處理對空腸雙歧桿菌和乳酸桿菌有降低的趨勢，但無顯著差異（P＞ 0.05）。

表5 溶菌酶對42d肉雞空腸食糜微生物數(shù)量的影響

2.3 溶菌酶對肉雞免疫器官指數(shù)的影響 見表6。從表6可見，與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2可顯著降低肉雞胸腺指數(shù)分別達(dá)31.3%和26.9%（P＜0.05），溶菌酶組1胸腺指數(shù)降低16.8%（P＞0.05）；與對照組相比，溶菌酶組2可顯著降低法氏囊指數(shù)23.3%（P＜0.05），抗生素與溶菌酶組1也可降低法氏囊指數(shù)，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.4 溶菌酶對42 d肉雞血清新城疫抗體效價的影響 見表6。從表6可以看出，與對照組相比，溶菌酶組1極顯著降低了肉雞血清新城疫抗體水平21.1%（P＜0.01），抗生素組及溶菌酶組2也顯著降低了 15.8%和 15.8%（P＜0.05），3個試驗組間抗體水平差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 溶菌酶對肉雞細(xì)胞免疫因子的影響 見表7。從表7可以看出，與對照組相比抗生素組及溶菌酶組2脾臟IL-1β mRNA表達(dá)豐度極顯著降低19.3%和24.6%（P＜0.01），溶菌酶組2相對溶菌酶組1 IL-1β mRNA表達(dá)豐度降低了18.9%（P＜0.05）；與對照組相比，不同試驗處理組脾臟TNF-α mRNA表達(dá)豐度均有所降低但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

表6 溶菌酶對42 d肉雞免疫器官指數(shù)和ND抗體水平的影響

表7 溶菌酶對42 d肉雞脾臟細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β mRNA 表達(dá)豐度的影響

2.6 溶菌酶對肉雞生產(chǎn)性能的影響 見表8。從表8可以看出，試驗前期肉雞的平均日采食量各組之間差異顯著（P＞0.05）；試驗各處理組料重比均有降低的趨勢，與對照組相比，抗生素組降低了9.8%，兩個溶菌酶組分別降低了7.0%和8.0%。與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2顯著提高了前期肉雞的平均日增重（P＜0.05），分別提高了11.1%和7.3%。各處理對后期肉雞的平均日采食量無顯著影響（P＞0.05）；與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2顯著提高了后期肉雞的平均日增重 （P＜0.05），提高幅度分別達(dá)到12.4%和12.2%；與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組1分別降低了料重比10.2%和9.0%，但差異不顯著（P＞0.05），溶菌酶組2肉雞后期料重比則顯著降低了 11.0%（P ＜0.05）。

從全期數(shù)據(jù)來看，與對照組相比，3個處理組對肉雞平均日采食量無顯著影響（P＞0.05）；各處理組均極顯著提高了肉雞平均日增重和料重比（P＜0.01）。使用溶菌酶與抗生素在平均日采食量、日增重及料重比方面未表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05），溶菌酶組2相對溶菌酶組1料重比降低了2.58%（P ＞ 0.05）。

表8 溶菌酶對不同階段肉雞生產(chǎn)性能的影響

3 討論

3.1 溶菌酶對肉雞食糜微生物數(shù)量的影響 腸道菌群最終反映其與宿主的共生關(guān)系，微生物的變化會影響動物的健康、生長及成熟（Hill，1982）。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶菌酶同抗生素一樣影響了肉雞的腸道微生物數(shù)量，且對革蘭氏陽性菌如梭菌更為敏感，主要原因是革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁組成主要是肽聚糖，會被溶菌酶中N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶直接水解而導(dǎo)致死亡，這與楊露青等（2003）研究報道的結(jié)論較類似。本試驗還發(fā)現(xiàn)，溶菌酶對雙歧桿菌和乳酸桿菌無顯著影響 （P＞0.05），可能原因是雙歧桿菌和乳酸桿菌這2種微生物因梭菌數(shù)量減少而具備了增殖優(yōu)勢，另外跟這種細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點有關(guān)。

3.2 溶菌酶對肉雞免疫機(jī)能的影響

3.2.1 溶菌酶對肉雞免疫器官和體液免疫的影響機(jī)體免疫器官指數(shù)如法氏囊指數(shù)反映了動物的免疫器官發(fā)育狀況和免疫功能。本試驗發(fā)現(xiàn)，溶菌酶和抗生素在一定程度上降低肉雞免疫器官指數(shù)和ND抗體水平，有降低動物免疫活化狀況的趨勢，與佟建明等（2001）研究結(jié)果類似。

3.2.2 溶菌酶對肉雞細(xì)胞因子的影響 抗生素通過抑制或殺滅病原微生物，減少機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而降低細(xì)胞因子如IL-1的水平，降低動物的免疫應(yīng)激（Roura等，1991），進(jìn)而改變飼料效率。微生物會影響細(xì)胞因子含量（Hill等，1952）。動物生長性能的下降是感染的反應(yīng)（Murray，1979），并且它至少一部分是受IL-1調(diào)節(jié) （Mccarthy等，1985）。這種下降也是由于基礎(chǔ)代謝率的提高、營養(yǎng)物質(zhì)吸收的變化及組織成分改變所致（Klasing和Peng，1987）。本試驗發(fā)現(xiàn)，抗生素組及溶菌酶組2脾臟IL-1β mRNA水平極顯著降低 （P＜0.01），不同試驗處理脾臟TNF-α mRNA水平也均有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），表明溶菌酶與抗生素有類似作用：通過減少微生物特別有害微生物的數(shù)量，降低微生物對動物免疫系統(tǒng)的刺激，從而一定程度上抑制了致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，這與 Naqi（1984）、Roura（1991）報道類似。 導(dǎo)致此現(xiàn)象的另一可能原因是溶菌酶通過靜電作用結(jié)合脂質(zhì)A和脂多糖，導(dǎo)致?；湽袒蛢?nèi)毒素分子從立方體形向多層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而阻止內(nèi)毒素與巨噬細(xì)胞受體互作，減少促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子如IL-1、IL-6 及 TNF-α 的釋放 （Klaus等，1998；Takada 等，1994）。

3.3 溶菌酶對肉雞生產(chǎn)性能的影響 關(guān)于溶菌酶與抗生素在畜禽中應(yīng)用的效果比較已有報道。孫小青（2008）研究表明,溶菌酶取代抗生素可顯著提高肉鴨增重2.33%（P＜0.05）和降低增重成本（P＜0.05），對料重比也有改善，綜合其他指標(biāo)溶菌酶在肉鴨中應(yīng)用總體效果好于抗生素。張世卿等（2008）也發(fā)現(xiàn)，添加溶菌酶可降低肉仔雞采食量、料重比，提高日增重，且一定添加量可顯著改善肉雞全期（0～6周齡）日增重和料重比（P＜0.05）。Brooke等（2002）使用老鼠表達(dá)的溶菌酶飼喂肉雞也有較好的促生長效果。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同處理對肉雞不同階段日采食量并無顯著影響（P＞0.05），原因可能是肉雞采食量更多受日糧能量水平等因素的影響；300 g/t溶菌酶對肉雞平均日增重和料重比均有顯著改善（P＜0.05），與抗生素的效果無差別（P＞0.05），可能原因是溶菌酶減少了有害微生物對肉雞腸道的刺激，雞的免疫器官發(fā)育變慢，炎性因子降低，攝入的營養(yǎng)用于維持減少，從而用于生產(chǎn)的數(shù)量相應(yīng)增加，所以在采食量不變的情況下，肉雞增重增加。

4 結(jié)論

4.1 飼料中添加溶菌酶可降低食糜中有害微生物（梭菌和大腸菌類）數(shù)量（P＜0.05）；一定程度上降低了肉雞免疫器官指數(shù)、新城疫抗體水平、IL-1β mRNA和TNF-α mRNA的表達(dá)豐度。

4.2 溶菌酶對肉雞平均日采食量無顯著影響（P＞0.05），極顯著提高了整個試驗期肉雞平均日增重，降低了料重比（P＜0.01），每噸飼料添加150 g溶菌酶可替代抗生素不影響肉雞生產(chǎn)性能。

[1]孫小青.在肉鴨日糧中溶菌酶與幾種抗生素的飼用價值比較：[碩士學(xué)位論文][D].重慶：西南大學(xué)，2008.

[2]佟建明，張日俊，薩仁娜，等.持續(xù)、低劑量重金霉素對肉雞免疫機(jī)能的抑制作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34（2）：200 ～ 204.

[3]楊漢春.動物免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003.

[4]楊露青，薛金花，何愛桃，等.溶菌酶抑菌作用檢測方法研究[J].American Journal of Chinese Medicine，2003，5：3.

[5]張世卿，朱忠珂，王明成，等.玉米-豆粕日糧添加溶菌酶對肉仔雞生長性能、代謝及免疫指標(biāo)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2008，20（4）：463 ～ 468.

[6]Brooke D，Humphrey，Ning Huang，et al.Rice Expressing Lactoferrin and Lysozyme Has Antibiotic-Like Properties When Fed to Chicks[J].Journal of Nutrition，2002，32：1214 ～ 1218.

[7]Harrned B K，Cunningham R W，Clark M C，et al.The pharmacology of duomycin[M].Annals of the New York Academy of Sciences，1948，51：182.

[8]Hill D C，Branion H D，Slinger S I，et al.Influence of environment on the growth response of chicks to penicillin[J].Poultry Science，1952，32：464 ～ 466.

[9]Hill M J.Gut flora associated diseases in man[J].Journal of Veterinary Medical Science，1982，33：32 ～ 36.

[10]Klasing K C，Peng R K.Influence of cell source，stimulating agents，and incubation conditions on release of interleukin-1 from chicken macrophages[J].Developmental and Comparative Immunology，1987，11：385 ～ 394.

[11]Klaus Brandenburg，Michel H J，Koch，et al.Biophysical characterisation of lysozyme binding to LPS Re and lipid A[J].European Journal of Biochemistry，1998，258：686 ～ 695.

[12]Mccarthy D O，Kluger M J，Vanderg A J.Suppression of food intake during infection：is interleukin-1 involved[J].American Journal of Clinical Nutrition，1985，42：1179 ～ 1182.

[13]Murray M J，Murray A B.Anorexia of infection as a mechanism of host defense[J].American Journal of Clinical Nutrition，1979，32：593 ～ 596.

[14]Naqi S A，Shain N，Wagner G，et al.Adverse effects of antibiotics on the development of gut-associated lymphoid tissues and the serum globulins in chickens[J].American Journal of Veterinary Research，1984，45：1425 ～ 1429.

[15]Roura，Josep Homedes，Klasing K C.Prevention of Immunologie Stress Contributes to the Growth-Permitting Ability of Dietary Antibiotics in Chicks[A].Annual Meeting of the Poultry Science Association[C].1991.13.

[16]Takada K，Ohno N，Yadomae T.Lysozyme regulates LPS-induced interleukin-6 release in mice[J].Circulatory Shock，1994，44：169 ～ 174.