張 堅(jiān) ，高文遠(yuǎn) ,2,，王 娟 ，趙志勇

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立及有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量的測(cè)定

張 堅(jiān)1，高文遠(yuǎn)1,2,3，王 娟3，趙志勇3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

[目的]建立杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，并測(cè)定懸浮細(xì)胞中杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量。[方法]無(wú)菌條件下切取杠柳幼根誘導(dǎo)愈傷組織，將其進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，然后再將愈傷組織接種到液體培養(yǎng)基中建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，并測(cè)定細(xì)胞中杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量。[結(jié)果]建立了杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，并測(cè)定了細(xì)胞中杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量分別為4.06μg/g和1.92μg/g。[結(jié)論]通過(guò)組織培養(yǎng)方式可以成功建立杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，但細(xì)胞中有效成分含量低，需要進(jìn)一步對(duì)其基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行考察。

杠柳；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系；杠柳毒苷；4-甲氧基水楊醛

杠柳為蘿藦科杠柳屬植物杠柳，生于低山丘陵的溝谷、林緣、河邊、荒坡灌叢中。分布東北、華北、西北等地。杠柳用途廣泛，其根皮為傳統(tǒng)中藥香加皮，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的作用[1]。現(xiàn)代藥理研究表明其根部具有強(qiáng)心苷、杠柳苷等活性成分，具有強(qiáng)心、抗腫瘤等多種活性[2]。長(zhǎng)期以來(lái)香加皮作為傳統(tǒng)中藥，一直以根皮入藥，未見(jiàn)通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物的報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，生產(chǎn)其中有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛，是對(duì)傳統(tǒng)中藥香加皮擴(kuò)大藥源的一個(gè)新途徑，同時(shí)也為今后杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)化及工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 材料 杠柳種子采于天津薊縣山區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理 取杠柳種子，去除種纓，流水沖洗2 h，后放入洗衣粉洗滌液中浸泡30m，并用玻璃棒不斷的攪動(dòng)，再在流水下沖洗1～2 h。將洗好的種子放入超凈臺(tái)上，以70%的乙醇中浸30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3次，再用4%次氯酸鈉（NaClO）浸泡30min并用玻璃棒不斷攪動(dòng)，后用無(wú)菌水沖洗5次，吸干材料表面水分后接種到無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度（25+1）℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度3 000～4 000 lx，蔗糖30 g/L，初始pH6.0。3 d左右杠柳種胚萌動(dòng)，培養(yǎng)30 d胚芽可長(zhǎng)高5 cm左右。取無(wú)菌苗，將根切成5mm左右的切段，備用。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖 取無(wú)菌苗，將根切成5mm左右的切段，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（MS＋2，4－D（2，4－二氯苯氧基乙酸）2mg/L+BA（6-芐基腺嘌呤）1mg/L，蔗糖 30 g/L，初始 pH6.0，暗培養(yǎng)）1周左右可見(jiàn)根段膨脹，2周左右可見(jiàn)淡黃色疏松的愈傷組織產(chǎn)生，將生長(zhǎng)旺盛，發(fā)育良好的愈傷組織細(xì)胞系接種到繼代增殖培養(yǎng)基中（MS＋2，4－D1mg/L+BA0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，初始 pH6.0，暗培養(yǎng)），25 d繼代1次，繼代時(shí)選擇生長(zhǎng)良好、淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞團(tuán)小、含水量大愈傷組織進(jìn)行繼代。

1.2.3 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 將繼代培養(yǎng)4～5代的愈傷組織接入到附加2，4-D1mg/L+BA0.5mg/L的MS液體培養(yǎng)基中在三角瓶?jī)?nèi)繼代培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。方法是挑選生長(zhǎng)良好、疏松易碎的愈傷組織用鑷子夾碎，接入到液體培養(yǎng)基中。最初2～3代，每代培養(yǎng)時(shí)間7d左右，繼代時(shí)培養(yǎng)基過(guò)80目篩，篩除大顆粒，這樣3～4代便可形成穩(wěn)定、均一的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)體系，以后的繼代培養(yǎng)周期延長(zhǎng)到15 d左右一代。

1.2.4 杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量測(cè)定

1.2.4.1 色譜條件 HypersilODS2C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水（25∶10∶65）；柱溫30℃；流速1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm[3]

1.2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取杠柳毒苷1.2mg和4-甲氧基水楊醛2.4mg置于5mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得到杠柳毒苷0.24mg/L和4-甲氧基水楊醛0.48mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別取儲(chǔ)備液 2.5、25、50、250、500、1 000 μL，甲醇定容于10mL容量瓶中，配置成不同濃度的對(duì)照品溶液。

1.2.4.3 供試品溶液的制備 取懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，先抽濾除去培養(yǎng)液中的水分，然后在50℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，取0.5 g加入40mL 50%乙醇，超聲提取40 min后抽濾，將濾液濃縮至2 mL，微孔濾膜（0.22μm）過(guò)濾，備用。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述色譜條件進(jìn)樣20μL，以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作線性回歸，得杠柳毒苷回歸方程為Y=15 693X-1 884.3，線性范圍為0.06～24mg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6；4-甲氧基水楊醛回歸方程為Y=45 662X-5 334.3，線性范圍為0.12～48 g/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取樣品供試液，平行進(jìn)樣6次，測(cè)得杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛的峰面積，峰面積的相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別為1.8%和2.1%。

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取杠柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞按照樣品測(cè)定方法平行操作6份，測(cè)得杠柳毒苷的平均含量為4.16μg/g，RSD為1.6%；4-甲氧基水楊醛的平均含量1.93μg/g，RSD為2.5%。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品溶液在室溫下放置0、2、4、6、8 h后分別測(cè)定，杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛的RSD分別為2.2%和2.8%。表明本實(shí)驗(yàn)條件下樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量的杠柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞0.5 g（干質(zhì)量），加入對(duì)照品杠柳毒苷（含量為6mg/L）和4-甲氧基水楊醛（含量為3mg/L）各400μL，制備供試品溶液，按照樣品測(cè)定方法平行操作6份，結(jié)果杠柳毒苷平均回收率為102.8%，RSD為2.7%；4-甲氧基水楊醛平均回收率為99.4%，RSD為1.8%。

2.6 杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物含量的測(cè)定 取杠柳懸浮細(xì)胞，按1.2.4.3制備供試品，以外標(biāo)法計(jì)算杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛的含量。測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。實(shí)驗(yàn)平行3次。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.1 Determ ined Resultof Sam ples（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)添加外源性激素2，4－D和BA成功的誘導(dǎo)出了杠柳根愈傷組織，愈傷組織淡黃色、生長(zhǎng)迅速、結(jié)構(gòu)疏松、易于分離。將此愈傷組織接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)5～7代即可形成由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成的杠柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此培養(yǎng)條件下，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，一個(gè)周期內(nèi)（15 d左右）增殖速度為初始接種量的11倍以上，但有效成分含量較低，杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛僅為微克級(jí)，與文獻(xiàn)[4-5]記載的有效成分含量（毫克級(jí)）差距較大，其主要原因可能是細(xì)胞高度脫分化抑制了次生代謝產(chǎn)物的積累。故如何提高細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛的含量，協(xié)調(diào)好細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的積累和細(xì)胞生長(zhǎng)是下一步實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)，筆者將重點(diǎn)對(duì)基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件以及外源性激素進(jìn)行考察，并嘗試通過(guò)添加誘導(dǎo)子及兩步培養(yǎng)等方法提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的含量，以期獲得杠柳高產(chǎn)細(xì)胞系。

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1977,63:273-275.

[2]張?jiān)?王鋒鵬.杠柳屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2003,15(2):157-161.

[3]任曉亮,劉 虹,戚愛(ài)棣.HPLC法同時(shí)測(cè)定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛的方法改進(jìn)[J].天津中醫(yī)藥,2007,24(3):252-253.

[4]李天祥,張麗娟,劉 虹,等.不同采收期、不同產(chǎn)地香加皮中4-甲氧基水楊醛的測(cè)定[J].中草藥,2007,37(8):1256-1257.

[5]田俊生,李天祥.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地香加皮中杠柳毒苷的含量[J].中藥材,2006,29(8):799-800.

Establishmentof the cellsuspension culture system of perip loca sepium bunge and contentmeasurementof theeffective constituentof periplocin and 4-methoxysalicylaldehyde

ZHANG Jian1，GAOWen-yuan1,2,WANG Juan，etal
(1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of Scienceand Technology,Tianjin 300457,China)

[Objective]To establish the Cell Suspension Culture System of Periploca sepium Bunge and measure the constituent of Periplocin and 4-Methoxysalicylaldehyde.[Methods]Cutand collected the rootand induce callusunder sterile conditions.Then,propagate the callus for several cycles.Select eugonic and incompact callus and inoculate them to liquid medium to establish the System of Cell Suspension Culture.Then,measure the contentof Periplocin and 4-Methoxysalicylaldehyde in cell.[Results]The Cell Suspension Culture System of Periploca sepium bungewas established and the constituentof periplocin and 4-Methoxysalicylaldehydewasmeasured as 4.06μg/g and 1.92μg/g-respectively.[Conclusion]The Cell Suspension Culture System of Periploca sepium Bunge can be established successfully by tissue culture,but the effective constituentof the cellwas low,so itwas necessary to study theminimum medium and culture conditions further.

periploca sepium bunge；system ofcellsuspension culture；minimalmedium;periplocin；4-methoxysalicylaldehyde

R284.2

A

1672-1519(2010)02-0163-03

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（09ZCKFSH01100）。

張 堅(jiān)（1974-），男，博士，副教授，主要從事生藥和組織培養(yǎng)工作。

高文遠(yuǎn)。

2009-10-20）