李勇剛朱 默戴穎鈺陳劍華倪健坤郭 亮

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)及其并發(fā)癥是威脅人類健康的重要疾病之一,是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。在我國(guó),本病的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)[1]。巨噬細(xì)胞參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過程,并與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[2]。超小順磁性氧化鐵(ultrasm-all superparamag netic iron oxide,USPIO)是一種新型的血池型磁共振對(duì)比劑,能被巨噬細(xì)胞特異性吞噬。因此,采用USPIO增強(qiáng)MRI有望通過顯示AS斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)早期診斷及評(píng)估AS斑塊穩(wěn)定性。本研究通過球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)的辦法建立實(shí)驗(yàn)性兔AS模型,采用USPIO增強(qiáng)MRI檢測(cè)兔AS斑塊的形態(tài)、數(shù)目和成分,探索一種新的AS斑塊檢測(cè)及穩(wěn)定性評(píng)估方法。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制作

選用健康雄性新西蘭大白兔30只,體重1.5～2.0kg,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組20只,對(duì)照組10只。

AS模型制作采用球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)法。采用4F球囊導(dǎo)管,經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插入至胸主動(dòng)脈,加壓注入稀釋的碘普胺使球囊張開,壓力維持在4～5kPa。透視下定位,自胸主動(dòng)脈開始拉動(dòng)球囊至腹主動(dòng)脈末端,反復(fù)3次,術(shù)后每日肌注青霉素40萬(wàn)單位,連續(xù) 3d。2周后,模型兔行高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料委托蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料公司配制,成分比例為2%膽固醇、10%豬油、88%基礎(chǔ)飼料),飼養(yǎng)14周后行MRI檢查。

2.磁共振檢查

2.1 動(dòng)物麻醉:先經(jīng)耳緣靜脈注射地西泮(安定)1m l,然后肌注速眠新Ⅱ0.2m l/kg。

2.2 MR掃描序列及參數(shù):采用Philips Eclipse 1.5TMRI掃描儀,膝關(guān)節(jié)線圈。USPIO增強(qiáng)前、后掃描序列包括:3D-TOF(TR=30ms,TE=6.7ms,翻轉(zhuǎn)角 30°,層厚 2mm,層間距0mm,矩陣 192×512);橫斷面TFET1WI(TR=470m s,TE=5ms,翻轉(zhuǎn)角為80°,層厚 5mm,層間距 0mm,矩陣256×256);橫斷面脂肪抑制SE T1WI(TR=300ms,TE=15m s,層厚5mm,層間距0mm,矩陣256×256);橫斷面FSET2WI(TR=3000ms,TE=85ms,層厚 5mm,層間距0mm,矩陣256×256);橫斷面FSEPDWI(TR=2500m s,TE=11.5ms,層厚5mm,層間距0mm,矩陣256×256)和橫斷面FFE T2WI(TR=600ms,TE=13.4ms,翻轉(zhuǎn)角為 30°,層厚 5mm,層間距 0mm,矩陣192×256)。橫斷面掃描范圍包括右腎動(dòng)脈上、下方各4cm范圍。經(jīng)耳緣靜脈注入U(xiǎn)SPIO(蘇州大學(xué)材料與化工學(xué)部自制,直徑20nm)0.05mm ol/kg后,行MRI增強(qiáng)掃描,并間隔24h重復(fù)掃描一次,連續(xù)觀察5d。

2.3 圖像分析:觀察斑塊在不同序列上的信號(hào)變化,實(shí)驗(yàn)組測(cè)量USPIO增強(qiáng)前、后斑塊區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度,對(duì)照組測(cè)量相應(yīng)部位正常管壁信號(hào)強(qiáng)度。圖像信噪比計(jì)算公式如下:SNR=SI/SD。

SI(感興趣區(qū))為腹主動(dòng)脈管壁的平均信號(hào)強(qiáng)度,SD(背景)為掃描野背景信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的T2WI上,測(cè)量管壁SNR。連續(xù)觀察5d,根據(jù)SNR變化情況確定增強(qiáng)后斑塊強(qiáng)化的峰值時(shí)間。

3.病理檢查

利用空氣栓塞法處死動(dòng)物,解剖取出完整的主動(dòng)脈,10%福爾馬林液固定。實(shí)驗(yàn)組計(jì)算右腎動(dòng)脈上、下4cm范圍內(nèi)的斑塊,以各個(gè)斑塊為中心取病理標(biāo)本。對(duì)照組相應(yīng)范圍腹主動(dòng)脈取5個(gè)標(biāo)本,共獲得25張HE切片。所有標(biāo)本行HE染色和普魯士藍(lán)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊的形態(tài)、成分以及鐵染色情況。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,將模型組和對(duì)照組在注射USPIO前與注射后第4天所測(cè)的管壁SNR進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.動(dòng)物模型及病理檢查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組20例中,模型成功12例,8只意外死亡。存活12只兔均有斑塊形成,斑塊大部分位于腹主動(dòng)脈,模型成功率為60%。對(duì)照組未出現(xiàn)意外死亡。

病理檢查顯示對(duì)照組血管壁柔軟、富有彈性,管壁光滑未見AS斑塊,鏡下見管壁各層結(jié)構(gòu)清晰,動(dòng)脈內(nèi)膜厚度均勻一致,內(nèi)膜下未見泡沫細(xì)胞。普魯士藍(lán)染色顯示對(duì)照組兔腹主動(dòng)脈管壁標(biāo)本均未見鐵顆粒沉積。

實(shí)驗(yàn)組12例掃描范圍內(nèi)共可見86個(gè)AS斑塊,腹主動(dòng)脈血管壁僵硬、彈性差,管腔內(nèi)高低不平,可見多個(gè)淡黃色斑塊凸出于管腔(圖1)。鏡下見動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚,內(nèi)膜下可見大量含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞,粥樣壞死物,管壁肌層可見增厚,平滑肌細(xì)胞增生,8個(gè)斑塊內(nèi)可見鈣化成分,11個(gè)斑塊纖維帽破損;高倍鏡下斑塊內(nèi)可見膽固醇針形結(jié)晶。普魯士藍(lán)染色顯示86個(gè)斑塊中,67個(gè)斑塊內(nèi)可見數(shù)量不等的鐵顆粒沉積,呈紫藍(lán)色(圖2)。

2.MRI表現(xiàn)

對(duì)照組USPIIO增強(qiáng)前、后MRI示掃描范圍內(nèi)腹主動(dòng)脈管腔清晰,未見異常信號(hào)。3D-TOF序列示管壁光整,未見管腔狹窄。

與病理檢查對(duì)照發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組67個(gè)普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性斑塊中,USPIO增強(qiáng)MRI可見明顯信號(hào)改變者共53個(gè),占79.1%。根據(jù)斑塊內(nèi)成分不同,MRI掃描信號(hào)各異。中央脂質(zhì)核心呈不規(guī)則小點(diǎn)片狀T1WI(圖3A)、PDWI(圖 3B)及 T2＊WI(圖3C)稍高信號(hào)區(qū),T2WI(圖3D)呈等、低信號(hào),脂肪抑制SE T1WI序列斑塊中央高信號(hào)區(qū)信號(hào)減低不明顯。纖維帽呈等T1、等T2信號(hào),在 PDW I序列顯示較好,呈稍高信號(hào),7個(gè)斑塊示纖維帽不完整,主要表現(xiàn)為纖維帽表面不規(guī)則。鈣化部分呈點(diǎn)狀長(zhǎng)T1、短 T2信號(hào)。USPIO增強(qiáng)后T2WI及T2＊WI可見斑塊中央信號(hào)明顯明顯降低,以T2＊WI更為明顯(圖3E),注射對(duì)比劑后 96h負(fù)性強(qiáng)化達(dá)峰值,斑塊表面纖維帽及斑塊深部管壁信號(hào)變化均未見明顯變化。T1WI序列的斑塊早期信號(hào)輕度增高,以后信號(hào)變化不明顯。USPIO增強(qiáng)后各序列對(duì)纖維帽信號(hào)區(qū)別能力沒有明顯增加。MRI平掃白血序列顯示斑塊局部管腔不同程度環(huán)形或偏心狹窄,USPIO增強(qiáng)后后96h白血序列顯示斑塊區(qū)管壁信號(hào)明顯減低(圖3F)。對(duì)照病灶部位普魯士藍(lán)染色及HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),藍(lán)染的鐵顆粒主要沉積在內(nèi)膜下、泡沫細(xì)胞中以及泡沫細(xì)胞融合崩解的粥樣壞死物中。在內(nèi)膜脫落區(qū)及破裂的纖維帽裂口處亦可見部分藍(lán)染的鐵顆粒沉積。在完整的纖維帽、鈣化區(qū)、斑塊內(nèi)纖維素樣壞死區(qū)、深部平滑肌增殖區(qū)、深部及管周炎性反應(yīng)區(qū)均未見鐵顆粒沉積。普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性斑塊中,MRI未發(fā)現(xiàn)明顯信號(hào)改變者共14個(gè),與病理對(duì)照發(fā)現(xiàn),其內(nèi)鐵顆粒沉積較少。

3.注射USPIO前后管壁SNR的定量測(cè)量。

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組USPIO增強(qiáng)前、后T2WI上病變區(qū)SNR測(cè)量結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)組USPIO增強(qiáng)前、后T2WI上病變區(qū)SNR的變化趨勢(shì)是起始逐漸下降,第4天達(dá)到最低點(diǎn)然后開始回升(圖4)。

表1 兩組注射USPIO前后血管壁SNR的定量測(cè)量結(jié)果

討 論

新西蘭大白兔是目前應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)性AS模型動(dòng)物,Rekhter等[3]研究發(fā)現(xiàn)兔AS斑塊與人類AS斑塊在病理特征上具有極大相似性。目前,實(shí)驗(yàn)性兔動(dòng)脈粥樣硬化模型建立的方法主要有高脂飲食飼養(yǎng)以及球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)的方法。單純高脂飲食飼養(yǎng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于胸主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓及頸動(dòng)脈分叉等處。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼養(yǎng)加球囊拉傷的方法可使粥樣斑塊發(fā)生在易行磁共振檢查的腹主動(dòng)脈,研究結(jié)果顯示,腹主動(dòng)脈的中下段即球囊損傷的主要部位,可見較多斑塊,部分呈片狀分布,與胸主動(dòng)脈及頸動(dòng)脈分叉等部位比較,腹主動(dòng)脈中下段背景噪聲小,血流偽影較少,圖像質(zhì)量易控制,且模型成功率高、制作周期短。

在AS發(fā)生發(fā)展過程中,巨噬細(xì)胞充當(dāng)了至關(guān)重要的作用。病變?cè)缙谠诰植考?xì)胞因子、趨化因子作用下,外周血單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)膜,轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì),形成泡沫細(xì)胞,泡沫細(xì)胞的沉積,構(gòu)成了粥樣硬化斑塊的主要成分。隨著AS病變進(jìn)一步加重,在巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞作用下,使T輔助細(xì)胞和樹突細(xì)胞相互間的作用加強(qiáng)導(dǎo)致了斑塊的破裂和血管內(nèi)血栓形成[4]。巨噬細(xì)胞參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過程,并與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),諸多組織學(xué)資料表明斑塊內(nèi)的炎癥細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)的多少是決定宏觀上斑塊不穩(wěn)定性程度的重要因素,即斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞越多則越趨于不穩(wěn)定[5,6]。因此,將巨噬細(xì)胞作為成像的靶細(xì)胞可早期診斷AS病變并有助于評(píng)估斑塊穩(wěn)定性。

本研究顯示靜脈注入U(xiǎn)SPIO能被AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬,其引起的信號(hào)變化能被MRI白血及黑血成像序列檢測(cè)到。斑塊內(nèi)的脂質(zhì)成分在T1WI、PDW I和 T2＊WI為稍高信號(hào),在T2WI上呈等低信號(hào),這主要是由于纖維斑塊期脂質(zhì)核心形成后,其中心主要成分是膽固醇和含固態(tài)結(jié)晶或液晶態(tài)的膽固醇酯,由于膽固醇固體結(jié)晶及液晶態(tài)的膽固醇酯的T 2值較脂類明顯縮短,故其信號(hào)強(qiáng)度降低[7,8]。斑塊內(nèi)不規(guī)則顆粒狀脂質(zhì)核心的高信號(hào)在T1WI脂肪抑制序列上沒有完全的降低,這說明脂質(zhì)核心的高信號(hào)與普通脂肪的高信號(hào)是有區(qū)別的,病理切片上也發(fā)現(xiàn)了病灶內(nèi)存在膽固醇結(jié)晶。國(guó)內(nèi)、外研究也發(fā)現(xiàn)[9-11],復(fù)合斑塊中的脂質(zhì)核心成分較復(fù)雜,其中有膽固醇、膽固醇結(jié)晶、中性脂肪、磷脂等,所以常規(guī)的脂肪抑制序列不能被抑制。纖維帽成分在PDW I序列顯示較其他序列清晰,呈稍高信號(hào)。雖然在部分病理切片發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)存在鈣化改變但在MRI上不易明確區(qū)分。注射USPIO后,MRI上主要表現(xiàn)為斑塊中央高信號(hào)的脂質(zhì)核心區(qū)信號(hào)降低明顯,纖維帽及深部管壁信號(hào)降低不明顯。鐵顆粒主要沉積在內(nèi)膜下、泡沫細(xì)胞中以及泡沫細(xì)胞融合崩解的粥樣壞死物中。在內(nèi)膜脫落區(qū)及破裂的纖維帽裂口處亦可見部分藍(lán)染的鐵顆粒沉積。完整的纖維帽、鈣化區(qū)、斑塊內(nèi)纖維素樣壞死區(qū)、深部平滑肌增殖區(qū)、深部及管周炎性反應(yīng)區(qū)均未見鐵顆粒沉積。這提示靜脈注射USPIO后,對(duì)比劑主要被大量聚集于內(nèi)膜下及脂質(zhì)核心區(qū)的巨噬細(xì)胞吞噬,從而引起MRI信號(hào)變化,也說明巨噬細(xì)胞在斑塊脂質(zhì)核心形成、擴(kuò)大、斑塊破裂中起著重要的作用,其聚集程度是判斷斑塊的活動(dòng)性及穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。在MRI上,完整或破裂纖維帽區(qū)信號(hào)變化均不明顯,可能是由于該區(qū)鐵顆粒沉積不如脂質(zhì)核心區(qū)多,且纖維帽在各個(gè)序列上信號(hào)強(qiáng)度偏低,USPIO主要是負(fù)性強(qiáng)化,因此,信號(hào)變化不如脂質(zhì)核心明顯。T2WI上監(jiān)測(cè)管壁SNR變化曲線顯示,注射USPIO前和以后的連續(xù)5d SNR的變化趨勢(shì)是起始逐漸下降,在第4天達(dá)到最低點(diǎn),然后開始回升,這說明巨噬細(xì)胞對(duì)鐵顆粒吞噬的峰值時(shí)間在96h左右。本研究結(jié)果顯示,USPIO增強(qiáng)MRI基本能反映AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集部位及聚集程度,有望用于斑塊活動(dòng)性及穩(wěn)定性評(píng)估。本研究由于受MRI儀場(chǎng)強(qiáng)及線圈等因素影響,圖像分辨率有待提高。采用超高場(chǎng)強(qiáng)及專用線圈,提高探測(cè)敏感性及圖像分辨率,有望更精確地評(píng)估病變內(nèi)巨噬細(xì)胞的分布及聚集程度。

多序列MRI成像有助于AS斑塊成分的分析及斑塊穩(wěn)定性判斷,PDW I序列對(duì)纖維帽顯示較佳,有利于觀察纖維帽完整性。T2＊WI序列對(duì)USPIO增強(qiáng)后斑塊的負(fù)性強(qiáng)化顯示較敏感,有利于評(píng)估斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量及評(píng)估斑塊炎癥反應(yīng)。MRI白血序列檢出斑塊數(shù)多于黑血序列,黑血技術(shù)對(duì)顯示斑塊大小、形態(tài)及成分優(yōu)于白血技術(shù),對(duì)斑塊性質(zhì)及穩(wěn)定性的評(píng)估價(jià)值較大,3D-TOF MRA覆蓋范圍大,對(duì)斑塊檢出敏感、直觀,可作為黑血成像前的定位手段。

總之,靜脈注入血池型MRI對(duì)比劑USPIO能被兔AS斑塊中巨噬細(xì)胞吞噬并導(dǎo)致斑塊MRI信號(hào)發(fā)生明顯變化,且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),MRI多序列成像有助于顯示斑塊內(nèi)不同成分,USPIO增強(qiáng)MRI有望用于AS診斷及斑塊穩(wěn)定性評(píng)估。

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