蔡 慎，鄭英麗，陳寶玲，方 麗

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院藥劑科，北京市 100037）

1975年St.Thomas首次將心臟停跳液引入臨床[1，2]，我院在此基礎(chǔ)上于1980年研制出復(fù)方鉀鈣鎂液，用于心臟直視手術(shù)前的心臟停跳。經(jīng)20余年臨床實踐證明，該液未見明顯不良反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于心外科手術(shù)中。目前國家對于注射劑質(zhì)量高度關(guān)注，《化學(xué)藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》規(guī)定注射劑均應(yīng)設(shè)細菌內(nèi)毒素（或熱原）檢查項。為了更有效地控制制劑質(zhì)量，保證臨床用藥的安全，本文對該液進行了細菌內(nèi)毒素檢查的方法學(xué)研究，以期為建立其內(nèi)毒素檢查方法提供依據(jù)，同時也希望能為其他同類制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號：0802290，規(guī)格：每支0.1 mL，靈敏度：0.25 EU·mL－1；湛江安度斯生物有限公司，批號：0806181，規(guī)格：每支0.1 mL，靈敏度：0.25 EU·mL－1；湛江安度斯生物有限公司，批號：0903131，規(guī)格：每支0.1 mL，靈敏度：0.03 EU·mL－1）；細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-200963，規(guī)格：每支120 EU）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號：090511，規(guī)格：每支2 mL，內(nèi)毒素含量：＜0.005 EU·mL－1）；復(fù)方鉀鈣鎂液（自制，批號：20090305、20090326、20090423，規(guī)格：每支10 mL，含氯化鉀0.3725 g、氯化鈣0.145 g、氯化鎂1.625 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

按照《中國藥典》2005年版二部附錄細菌內(nèi)毒素檢查法[3]規(guī)定，根據(jù)鱟試劑標(biāo)示靈敏度，將細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混合15 min，然后，制備成2、1、0.5、0.25 λ 4個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時用細菌內(nèi)毒素檢查用水2支作為陰性對照管（記作NC）。鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果見表1。

從表1可見，3批鱟試劑靈敏度的測定值（λc）均在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，表明各批鱟試劑靈敏度符合規(guī)定。

2.2 細菌內(nèi)毒素限值的確定

按公式L＝K/M[3]，K為人用每kg體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU·（kg·h）－1。M為以成人用每kg體質(zhì)量每小時的最大供試品劑量，人均體質(zhì)量按60 kg計算。本品在臨床使用中，于500 mL生理鹽水中加入本品10～20 mL，將其向心肌灌注。時間以1 h計；因此用藥的最大劑量M＝0.33 mL/（kg·h）－1，計算得內(nèi)毒素限值L為L＝K/M＝5/0.33＝15 EU·mL－1。因本品與大輸液聯(lián)合使用，為保證臨床應(yīng)用的安全性，根據(jù)復(fù)方、輸液、工藝易污染者從嚴(yán)原則，加上安全系數(shù)。在上述計算限度基礎(chǔ)之上將限度要求提高3～10倍[4，5]，因此將本品L值定為1.5 EU·mL－1。

2.3 干擾預(yù)試驗

2.3.1 復(fù)方鉀鈣鎂液有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計算。用MVD＝CL/λ來確定MVD，其中L為復(fù)方鉀鈣鎂液的細菌內(nèi)毒素限值1.5 EU·mL－1，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，目前購買到的鱟試劑靈敏度（λ）的范圍一般在0.03～0.5 EU·mL－1，則本品的最大有效稀釋倍數(shù)為3～50倍。

2.3.2 試驗操作。將復(fù)方鉀鈣鎂液用細菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋為3、6、12、24倍稀釋液，將此系列稀釋溶液記為NPC。根據(jù)使用鱟試劑的靈敏度，在上述試驗溶液中加入細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2 λ濃度的細菌內(nèi)毒素，記此系列溶液分別為PPC。取靈敏度為0.25 EU·mL－12個不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC和NPC進行反應(yīng)，每一倍數(shù)重復(fù)2管，并另取細菌內(nèi)毒素檢查用水和含2 λ的內(nèi)毒素溶液分別作2支陰性對照（NC）管和陽性對照（PC）管。進行3個批號樣品預(yù)干擾試驗，結(jié)果見表2。

表2 樣品干擾預(yù)試驗結(jié)果Tab 2 Results of interference pretest for samples

預(yù)試驗結(jié)果初步表明，2個廠家的鱟試劑對3批樣品的細菌內(nèi)毒素的試驗結(jié)果均在供試品6倍及其以上稀釋倍數(shù)時對鱟試劑的凝膠化反應(yīng)不存在干擾作用。

2.4 干擾試驗

為了最終確認(rèn)是否存在干擾因素的影響，進行以下正式干擾試驗。取復(fù)方鉀鈣鎂液用細菌內(nèi)毒素檢查用水分別進行稀釋，使其最終干擾試驗稀釋倍數(shù)為6倍，按《中國藥典》2005年版二部附錄中的“細菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗項”[3]進行試驗，結(jié)果見表3。

表3 樣品干擾試驗結(jié)果Tab 3 Results of interference test for samples

由表3可見，3個批號復(fù)方鉀鈣鎂液對2個廠家鱟試劑的干擾試驗結(jié)果，最大濃度2.0 λ管結(jié)果均為陽性，最低濃度0.25 λ管結(jié)果均為陰性；對于λ＝0.25 EU·mL－1的2組鱟試劑的Es均為0.25 EU·mL－1，在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，3個批號樣品測得的的Et值均在0.5 Es～2.0 Es范圍內(nèi)，結(jié)果表明該樣品進行6倍稀釋后，對不同廠家的鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)均無干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用細菌內(nèi)毒素檢查法。

2.5 細菌內(nèi)毒素半定量分析方法的確立

本品經(jīng)過干擾試驗驗證稀釋6倍后無干擾。計算：MVD＝CL/λ＝1.5/0.03＝50倍。用細菌內(nèi)毒素檢查用水將本品分別稀釋為6、12、24、48倍。用靈敏度λ為0.03 EU·mL－1的鱟試劑作內(nèi)毒素檢查，按《中國藥典》2005年版二部附錄的凝膠半定量檢測規(guī)定[3]進行。得到同樣的反應(yīng)終點濃度結(jié)果，詳見表4。

表4 3批樣品半定量分析結(jié)果Tab 4 Results of semi-quantitative analysis for 3 batches of samples

由表4可見，陰性對照溶液結(jié)果為陰性，樣品陽性對照結(jié)果為陽性，系列溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值均在規(guī)定的范圍之內(nèi)，其符合試驗有效的條件成立，故本試驗結(jié)果有效。按照公式CE＝lg－1（∑X/2）計算內(nèi)毒素濃度，得3批樣品內(nèi)毒素含量分別為0.36 、0.36、0.255 EU·mL－1，均小于1.5 EU·mL－1。故半定量法可以反映出細菌內(nèi)毒素的真正含量。

3 討論

適合鱟試劑反應(yīng)水平的pH值范圍為6.8～8.0，藥物pH值過于偏酸或偏堿，超出了鱟試劑緩沖能力就可抑制或促進凝聚的形成[6]。本品的pH值范圍為4.80～5.20，對細菌內(nèi)毒素檢查法存在干擾，經(jīng)用2個廠家鱟試劑對樣品分別進行干擾試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)稀釋至6倍時，在鱟試劑靈敏度為0.25 EU·mL－1時均不對試驗產(chǎn)生干擾作用。通過試驗結(jié)果證實了此干擾作用可通過稀釋樣品而消除。使用細菌內(nèi)毒素半定量分析法，可以將供試品溶液中的細菌內(nèi)毒素的量確定在某一小范圍之內(nèi)。本試驗結(jié)果表明，選擇適當(dāng)濃度的稀釋液按半定量法進行試驗，可以直觀地計算出其細菌內(nèi)毒素近似含量。本品3批細菌內(nèi)毒素含量均小于其限值1.5 EU·mL－1。

復(fù)方鉀鈣鎂液是我院非法定制劑，《中國藥典》尚無其內(nèi)毒素檢查的標(biāo)準(zhǔn)，為此筆者通過試驗建立了復(fù)方鉀鈣鎂液內(nèi)毒素檢查的方法，其細菌內(nèi)毒素限值可定為每毫升復(fù)方鉀鈣鎂液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于1.5 EU。

[1]Braimbridge MV，Chayen J，Bitensky L，et al.Cold cardioplegia or continuous coronary perfusion?[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1977，74（2）：900.

[2]Hearse DJ，Braimbridge MV，Jynge P.Protection of the ischemic myocardium：cardioplegia[M].New York：Raven Press，1981：341～352.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄85.

[4]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心.藥品技術(shù)評價文集（第二輯）[M].第1版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2008：196～200.

[5]黃清泉，夏振民.藥品細菌內(nèi)毒素檢查的實驗設(shè)計[J].中國藥學(xué)雜志，1997，32（2）：72.

[6]周學(xué)琴，張 麗，王迎春.果糖二磷酸鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國藥房，2004，15（4）：242.