姚金成，饒健，曾令貴#，張陸勇，江振洲，何玲，胡領(lǐng)，趙緒元（.湖南省藥品審評認證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，長沙市 400；.中國藥科大學國家新藥篩選中心，南京市 0009；.中南大學湘雅二醫(yī)院，長沙市 400）

雷公藤是近半個世紀以來發(fā)生中毒事件最多的中草藥之一，其毒性在傳統(tǒng)中草藥中排第三，全株均有不同程度的毒性。雷公藤屬植物的化學成分非常復(fù)雜，迄今為止，已從雷公藤屬植物中分離得到大約100種成分[1]，其中二萜類是主要毒性成分，其次是生物堿類[2]。雷公藤甲素（Triptolide，又稱雷公藤內(nèi)酯醇）是從雷公藤中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯醇，是雷公藤中主要藥理活性及毒性成分[3]，其相關(guān)效價比雷公藤總苷高100～200倍[4]，是評價雷公藤藥材質(zhì)量好壞的主要指標，也是目前雷公藤制劑質(zhì)量控制標準的主要指標。

有較多的臨床病例報道了雷公藤及其制劑所導(dǎo)致的肝毒性。本課題組的前期研究結(jié)果表明，較高劑量多次ig給予雷公藤甲素能導(dǎo)致大鼠較明顯的肝毒性，那么這是否與影響肝藥酶P450而導(dǎo)致其代謝減慢有關(guān)？鑒于目前尚未見有關(guān)雷公藤甲素對肝藥酶P450影響的報道，故本研究擬探討雷公藤甲素對肝藥酶P450的影響，以期為臨床安全、合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

680型酶標儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；752C型紫外-可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；超速低溫離心機（美國Beckman公司）；T25型組織分散器（美國IKA公司）；核酸電泳儀（北京市六一儀器廠）；BS210S型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

雷公藤甲素原料藥（中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，純度＞96%）；雷公藤甲素對照品（中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；甲氧基異唑、乙氧基異唑、戊氧基異唑、牛血清白蛋白、Folin試劑、NADPH（美國Sigma公司）；紅霉素（上海生工生物工程有限公司）；Anti-rabbit CYP3A，CYP2E1，β-actin ant-ibodies and HRP-conjugated goat anti-rabbit Ig（美國Santa Cruz公司）；硝酸纖維素膜（美國Pall公司）；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（美國Roche公司）；甘氨酸（上海生工生物工程有限公司）；過硫酸胺（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；魯米諾發(fā)光底物試劑盒（美國Pierce公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物

SD大鼠48只，♀♂各半，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2003-0004）。

2 方法

2.1 分組及給藥

SD大鼠隨機分為8組，即1 d組（包括溶劑對照（丙二醇生理鹽水）及雷公藤甲素高、中、低劑量（450、300、150 μg·kg-1）組）和14 d組（包括溶劑對照（丙二醇生理鹽水）及雷公藤甲素高、中、低劑量（450、300、150 μg·kg-1）組）。ig給藥，每天1次。

2.2 大鼠肝微粒體的制備

SD大鼠禁食不禁水16 h，將大鼠斷頭處死并置冰板上，快速摘除肝臟，自門靜脈注入0～4℃冰浴生理鹽水，沖洗肝臟至土黃色，再用生理鹽水將血水沖洗干凈。將肝組織剪碎，采用差速離心法制備大鼠肝微粒體。具體操作方法為：先將肝勻漿在4 ℃以9000 r·min-1離心30 min，取上層，4 ℃下100000 r·min-1離心60 min，下層粉紅色沉淀即為所需的肝微粒體；將沉淀物懸浮于含30%甘油的KCl-磷酸鹽緩沖液中，置于－80℃冰箱內(nèi)貯藏，采用BCA法測定肝微粒體蛋白濃度。

2.3 含量測定

2.3.1 細胞色素P450含量測定：微粒體中P450含量按Omura法測定。將微粒體用KCl-磷酸鹽緩沖溶液稀釋成1.0 mg·mL-1，加入數(shù)毫克連二亞硫酸鈉，混勻，1 min后等分到參照杯和樣品杯中，在紫外分光光度儀上先掃描基線，然后在樣品杯中通入CO約1 min，穩(wěn)定5 min后在400～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，記錄450和480 nm波長處的吸光度（A），按以下公式計算P450含量：P450（nmol·mg-1）＝ΔA（450nm－480nm）×1000（91×微粒體蛋白濃度）。

2.3.2 細胞色素b5含量測定：將微粒體用KCl-磷酸鹽緩沖溶液稀釋成1.0 mg·mL-1，等分到參照杯和樣品杯中，在紫外分光光度儀上先掃描基線，然后在樣品池中加入數(shù)毫克連二亞硫酸鈉，混勻，在400～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，記錄423和500 nm波長處的A，按以下公式計算b5含量：b5（nmol·mg-1）＝ΔA（423nm－500nm）×1000/（171×微粒體蛋白濃度）。

2.4 紅霉素N-去甲基酶（ERD）活性測定

參考相關(guān)文獻[5]進行測定。

2.5 二甲基亞硝胺脫甲基酶（NDMA）活性測定

在空白管、標準管及樣品管中分別加入0.25 mL Tris-HCl緩沖液、0.15 mL蒸餾水、適量微粒體，使最終體積為0.5 mL，反應(yīng)液中含0.5 mg微粒體蛋白。樣品管中加入0.05 mL NDMA（100 mmol-1·L-1），標準管中加入10 μL甲醛溶液（3.33 mmol·L-1）。將以上各管放入37℃水浴中，預(yù)溫孵1 min，然后加入NADPH發(fā)生系統(tǒng)以起始反應(yīng)，溫孵20 min，用0.05 mL ZnSO（425%）終止反應(yīng)，立即混勻后加入0.05 mL飽和Ba（OH）2，2500 r·min-1離心20 min，分別取0.35 mL上清液，加入0.15 mL Nash試劑，混勻后放入50℃水浴中溫孵30 min，冷卻后加樣于96孔板上，用酶標儀在412 nm波長處測定A。

2.6 甲氧基異噁唑脫甲基酶（MROD）、乙氧基異噁唑脫乙基酶（EROD）、戊氧基異噁唑脫烷基酶（PROD）活性測定

反應(yīng)體系為肝微粒體100 μg、0.1 mol·L-1Tris緩沖液500 μL，甲氧基異唑2.5 μL，加重蒸水至900 μL，37 ℃水浴預(yù)孵5 min，加10 mmol·L-1NADPH液100 μL，空白管用重蒸水代替NADPH。37℃振蕩孵育20 min，各管加100 μL冰冷丙酮終止反應(yīng)，稍加離心，然后在530 nm波長處測定熒光值（F）。各管均設(shè)對照管，根據(jù)標準曲線計算異唑的濃度。

2.7 Western blotting法檢測大鼠肝微粒體CYP3A及CYP2E1蛋白的表達

樣品經(jīng)過相應(yīng)處理后，參照本課題組前期研究中Western blotting部分[5]，換相應(yīng)抗體后實驗方法做適當改變。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 雷公藤甲素對肝微粒體中細胞色素P450及b5含量的影響

14 d雷公藤甲素中劑量組在8 d有1只大鼠死亡，14 d雷公藤甲素高劑量組在7、11 d各有1只大鼠死亡。與溶劑對照組比較，雷公藤甲素高、中、低劑量組給藥1 d及14 d后，對細胞色素P450及b5含量無影響（P＞0.05）。雷公藤甲素對肝微粒體中細胞色素P450及b5含量的影響見表1。

表1 雷公藤甲素對肝微粒體中細胞色素P450及b5含量的影響（）Tab 1 Effects of triptolide on the content of cytochrome P450 and b5 in rat liver microsom（e）

表1 雷公藤甲素對肝微粒體中細胞色素P450及b5含量的影響（）Tab 1 Effects of triptolide on the content of cytochrome P450 and b5 in rat liver microsom（e）

細胞色素b5含量/nmol·mg-1 0.55±0.0670.53±0.240.46±0.0790.63±0.250.59±0.170.55±0.130.67±0.230.23±0.12組別1 d溶劑對照組1 d雷公藤甲素低劑量組1 d雷公藤甲素中劑量組1 d雷公藤甲素高劑量組14 d溶劑對照組14 d雷公藤甲素低劑量組14 d雷公藤甲素中劑量組14 d雷公藤甲素高劑量組劑量/μg·kg-1-150300450-150300450細胞色素P450含量/nmol·mg-1 0.53±0.140.59±0.110.48±0.160.56±0.150.56±0.270.63±0.230.55±0.240.49±0.17

3.2 雷公藤甲素對肝微粒體中ERD活性的影響

與溶劑對照組比較，1 d雷公藤甲素高、中、低劑量組ERD活性無顯著變化（P＞0.05）；14 d雷公藤甲素高劑量組ERD活性顯著減弱（P＜0.05）。ERD活力反映CYP3A的活性，據(jù)此初步推斷高劑量組給藥14 d后，對CYP3A酶活力具有一定的抑制作用。雷公藤甲素對肝微粒體中ERD活性的影響見表2。

3.3 雷公藤甲素對肝微粒體中NDMA活性的影響

與溶劑對照組比較，1 d雷公藤甲素高、中、低劑量組NDMA活性無顯著變化（P＞0.05）；14 d雷公藤甲素中劑量組NDMA活性略微下降（P＞0.05）；14 d雷公藤甲素高劑量組NDMA活性顯著降低（P＜0.05）。NDMA活力反映CYP2E1的活性，據(jù)此初步推斷雷公藤甲素高劑量組給藥14 d后，對CYP2E1酶活力具有一定誘導(dǎo)作用。雷公藤甲素對肝微粒體中NDMA活性的影響見表3。

表2 雷公藤甲素對肝微粒體中ERD活性的影響（）Tab 2 Effects of triptolide on the activity of ERD in rat liver microsom（e）

表2 雷公藤甲素對肝微粒體中ERD活性的影響（）Tab 2 Effects of triptolide on the activity of ERD in rat liver microsom（e）

與14 d溶劑對照組比較：＊P＜0.05vs.14 d solvent control group：＊P＜0.05

組別1 d溶劑對照組1 d雷公藤甲素低劑量組1 d雷公藤甲素中劑量組1 d雷公藤甲素高劑量組14 d溶劑對照組14 d雷公藤甲素低劑量組14 d雷公藤甲素中劑量組14 d雷公藤甲素高劑量組ERD活性/nmol·mg-1 0.74±0.250.61±0.160.85±0.150.78±0.240.87±0.220.74±0.170.66±0.190.43±0.14＊劑量/μg·kg-1-150300450-150300450

表3 雷公藤甲素對肝微粒體中NDMA活性的影響（）Tab 3 Effects of triptolide on the activity of NDMA in rat liver microsom（e）

表3 雷公藤甲素對肝微粒體中NDMA活性的影響（）Tab 3 Effects of triptolide on the activity of NDMA in rat liver microsom（e）

與14 d溶劑對照組比較：＊P＜0.05vs.14 d solvent control group：＊P＜0.05

組別1 d溶劑對照組1 d雷公藤甲素低劑量組1 d雷公藤甲素中劑量組1 d雷公藤甲素高劑量組14 d溶劑對照組14 d雷公藤甲素低劑量組14 d雷公藤甲素中劑量組14 d雷公藤甲素高劑量組劑量/μg·kg-1-150300450-150300450 NDMA活性/nmol·mg-1 4.73±0.714.97±0.623.96±0.684.14±0.774.49±0.964.73±0.856.55±1.488.24±1.62＊

3.4 雷公藤甲素對肝微粒體中MROD、EROD、PROD活性的影響

與溶劑對照組比較，1 d及14 d雷公藤甲素高、中、低劑量組MROD、EROD、PROD活性無顯著差異（P＞0.05）。雷公藤甲素對肝微粒體中MROD、EROD、PROD活性的影響見表4。

表4 雷公藤甲素對肝微粒體中MROD、EROD、PROD活性的影響（）Tab 4 Effects of triptolide on the activity of MROD,EROD and PROD in rat liver microsom（e）

表4 雷公藤甲素對肝微粒體中MROD、EROD、PROD活性的影響（）Tab 4 Effects of triptolide on the activity of MROD,EROD and PROD in rat liver microsom（e）

組別1 d溶劑對照組1 d雷公藤甲素低劑量組1 d雷公藤甲素中劑量組1 d雷公藤甲素高劑量組14 d溶劑對照組14 d雷公藤甲素低劑量組14 d雷公藤甲素中劑量組14 d雷公藤甲素高劑量組劑量/μg·kg-1-150300450-150300450 MROD活性/pmol·mg-1 4.71±0.874.95±0.614.74±0.685.17±0.554.63±0.823.87±0.774.24±0.754.70±0.93 EROD活性/nmol·mg-1 14.3±3.1112.8±2.2311.5±1.7916.8±2.6413.7±1.9813.8±2.3916.4±3.3115.7±2.77 PROD活性/nmol·mg-1 2.39±0.642.04±0.381.95±0.442.87±0.732.51±0.672.14±0.472.85±0.612.92±0.83

3.5 雷公藤甲素對大鼠肝微粒體CYP3A及CYP2E1蛋白表達的影響

雷公藤甲素高、中、低劑量組給藥1 d后，對CYP3A及CYP2E1蛋白的表達無影響（P＞0.05）；雷公藤甲素中、低劑量組給藥14 d后，對CYP3A及CYP2E1蛋白的表達無影響（P＞0.05）；雷公藤甲素高劑量組給藥14 d后，對CYP2E1蛋白的表達雖然有所增加，但與溶劑對照組比較無顯著差異（P＞0.05）；雷公藤甲素高劑量組給藥14 d后，對CYP3A蛋白的表達有顯著抑制作用（P＜0.05）。雷公藤甲素對肝微粒體中CYP3A及CYP2E1蛋白表達的影響見圖1。

4 討論

CYP2E1在肝臟中占CYP450s總量的7%[6]，是CYP450s中的重要成分，是許多低分子有機化合物及藥物在體內(nèi)的主要代謝酶（如乙醇、蒽氟烷、氯唑沙宗、對乙酰氨基酚等），煙草中的許多成分也通過CYP2E1在體內(nèi)進行生物轉(zhuǎn)化[7]。由于CYP2E1的活性存在個體和種族差異，其底物主要是人們經(jīng)常接觸的前致癌物和前毒物。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素高劑量組給藥14 d后，對NDMA活性有明顯誘導(dǎo)作用，與溶劑對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示高劑量的雷公藤甲素多次給藥可能誘導(dǎo)CYP2E1酶活力。因此，臨床上其它藥物與其聯(lián)合用藥時要引起注意。

CYP3A酶的組成成員包括CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5（25%成人肝臟中存在）、CYP3A7（胚胎肝臟中存在），其中以CYP3A4在肝臟含量最為豐富，是成人肝臟中的主要表達酶，能代謝多種藥物、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物、黃曲酶素B1和其它前致癌物，可參與近200種藥物的體內(nèi)代謝，約占全部藥物的50%[8]。本研究表明，高劑量組給藥14 d后，對CYP3A酶活力具有一定的抑制作用，提示雷公藤甲素可能與由CYP3A代謝的藥物存在代謝性相互作用。由于雷公藤甲素具有抗炎、抗菌、免疫抑制、抗生育、抗腫瘤活性，目前被廣泛應(yīng)用于類風濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎、紅斑狼瘡及各種皮膚病等50多種疾病的治療，其免疫抑制作用更是受到廣泛重視，因此更加增加了其與其它藥物合用的可能性。

藥物的代謝性相互作用中，由酶的抑制而引起的相互作用約占全部相互作用的70%，酶的誘導(dǎo)引起的相互作用約占23%，其它則只占7%[9]。而藥物間的代謝抑制一般被認為是一種潛在危險，應(yīng)盡量加以避免，如氯霉素與抗凝藥雙香豆素合用時，可使雙香豆素的代謝受阻而引起出血；酮康唑可以抑制特非那丁的代謝，使特非那丁的血藥濃度大幅提高而導(dǎo)致致命性的室性心律失常。

主要由CYP3A4代謝的藥物有大環(huán)類酯類抗生素、咪唑類抗真菌藥物、抗病毒藥、鈣拮抗藥、利福霉素類藥物及胡柚汁等，這些藥物與其它藥物合用可能夠誘導(dǎo)或抑制藥物代謝酶的活性而影響療效或出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)[10～12]。另有研究表明，臨床應(yīng)用的免疫抑制劑主要經(jīng)CYP3A4代謝[13，14]，且治療免疫系統(tǒng)疾病時，臨床常采用多種藥物聯(lián)合治療的方案。可見，研究雷公藤甲素對肝臟藥物代謝酶活性的影響具有十分重要的臨床意義。

圖1 雷公藤甲素對肝微粒體中CYP3A及CYP2E1蛋白表達的影響A.圖片；B.統(tǒng)計結(jié)果Fig 1 Effect of triptolide on the protein expression of CYP3Aand CYP2E1 in rat liver microsome.A.photograph；B.statisticod results

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