王娟，張晶，宋洪濤#，唐星，何仲貴

（1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福州市 350025；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)市 110016）

西羅莫司（Sirolimus，SRL）作為第3代免疫抑制劑，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的毒性較小的新型強(qiáng)效免疫抑制劑，其正成為腎移植患者長(zhǎng)期免疫抑制治療的基本藥物[1，2]。臨床主要用于抗器官移植抗排斥作用和治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、牛皮癬等自身免疫性疾病，其免疫抑制作用比環(huán)孢素強(qiáng)100倍，比他克莫司強(qiáng)30倍[3，4]。但由于其治療窗窄[5]，高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥等不良反應(yīng)發(fā)生率高，使其臨床應(yīng)用受限。因此，本課題擬研究制備SRL控釋制劑，以減小其用藥后導(dǎo)致的血藥濃度波動(dòng)，使藥物能夠更安全、有效地應(yīng)用于臨床。

滲透泵是迄今為止口服控釋制劑中釋藥特性最為理想的一種。目前研究難溶性藥物的滲透泵片主要有2種：雙層滲透泵片與單層高分子滲透泵片。由于雙層滲透泵片在生產(chǎn)中需快速、準(zhǔn)確地辨識(shí)藥物層后再打釋藥孔，設(shè)備智能化要求高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此本試驗(yàn)選擇制備SRL單層高分子滲透泵片。

1 儀器與試藥

BS124S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海雷磁科學(xué)儀器公司）；HP1100高效液相色譜系統(tǒng)（二級(jí)管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；TDP-5A型單沖壓片機(jī)（上海天凡藥機(jī)制造廠）；BY300A小型包衣機(jī)、YPD-200C型片劑硬度儀、RCZ-6BZ型藥物溶出度儀均由上海黃海藥檢儀器有限公司提供。

SRL對(duì)照品（含量：99.9%）、SRL原料藥（批號(hào)：060702，含量：99.5%）均由福建科瑞藥業(yè)有限公司提供；SRL單層高分子滲透泵控釋片（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院自制，規(guī)格：每片1 mg）；十二烷基硫酸鈉（SDS，諸暨豐盈化工有限公司）；聚氧乙烯（PEO，美國(guó)Dow公司）；乳糖（Lactose，美國(guó)MEGGLE公司）；甘露醇（Mannitol）、氯化鈉（NaCl）、醋酸纖維素（CA）、聚乙二醇（PEG400、PEG4000）均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外釋放度測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件。色譜柱：Zorbax SB-C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-乙腈（30∶30∶40）；流速：1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。以SRL峰計(jì)理論板數(shù)為1998，分離度為3.13。

2.1.2 釋放介質(zhì)的選擇。難溶性藥物進(jìn)行體外釋放度測(cè)定試驗(yàn)時(shí)，為保證釋放的漏槽狀態(tài)，常加入一定濃度的表面活性劑。由溶解度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可知，SRL在0.1%～0.5%SDS溶液中溶解度較高，均能夠達(dá)到漏槽條件，但參考已上市的SRL納米結(jié)晶片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，筆者選擇0.4%SDS溶液為釋放介質(zhì)。

2.1.3 線性關(guān)系考察。精密稱取SRL對(duì)照品5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容，得濃度為100 μg·mL－1貯備液。精密量取貯備液適量加0.4%SDS溶液稀釋成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y＝56.74X－0.3824（r＝0.9996）。結(jié)果表明，SRL檢測(cè)濃度的線性范圍為0.1～10μg·mL－1。經(jīng)考察，該方法的精密度結(jié)果為為0.74%，回收率為（98.3±0.81）%、RSD＝0.83%，24 h穩(wěn)定性性好（RSD＝1.39%），均符合規(guī)定。

2.1.4 釋放度測(cè)定方法。取樣品6片，裝入沉降籃中，按2005年版《中國(guó)藥典》（二部）釋放度測(cè)定法（附錄ⅩD第三法），采用溶出度測(cè)定法（2005年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅩC第三法）的裝置，以0.4%SDS溶液250 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r·min－1。在1、2、4、6、8、10、12 h分別取溶液5 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，并及時(shí)在操作容器中補(bǔ)充空白介質(zhì)溶液5 mL，分別精密量取續(xù)濾液適量，進(jìn)樣20 μL測(cè)定；另精密稱取SRL對(duì)照品適量，用上述溶出介質(zhì)制成2.0 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，分別計(jì)算不同時(shí)間內(nèi)SRL累積釋放度，繪制溶出曲線。

2.2 樣品制備工藝

2.2.1 SRL固體分散體的制備。為了提高SRL的溶解度，改善其在緩釋制劑中的溶出度，本課題前期研究了SRL的固體分散體。以SRL 10倍量的泊洛沙姆188（F68）為載體，先將SRL溶解于適量的乙醇溶液中，待F68加熱至熔融后，混勻，劇烈攪拌并將熔融物傾倒在不銹鋼板上形成薄層，使之迅速冷卻成固體，再將此固體置于真空干燥箱內(nèi)24 h，取出，研磨，過(guò)80目篩備用。

2.2.2 制備片芯。先將PEO、促滲劑分別粉碎過(guò)80目篩，稱取處方量的SRL固體分散體及其它輔料采用等量遞加法混合均勻，采用7.5 mm沖模直接壓片（藥物劑量為每片1 mg，硬度約為50 N），即得每片含SRL 1 mg的片芯。

2.2.3 包衣。將CA、PEG溶于丙酮-水（95∶5，V/V）中，即得包衣溶液。將片芯置于包衣鍋內(nèi)，在溫度40℃、包衣液輸入速度7.0～10.0 r·min－1、壓力0.6～0.8 MPa條件下進(jìn)行包衣操作，直至衣膜增重達(dá)到預(yù)定要求為止。在40℃下干燥24 h，然后在片劑表面打一釋藥小孔，即得SRL單層高分子滲透泵控釋片。

2.3 處方篩選單因素考察

影響單層高分子滲透泵控釋片釋藥行為的因素有很多，為簡(jiǎn)化試驗(yàn)，本研究在固定包衣工藝參數(shù)的條件下，對(duì)片芯組成、片芯制備工藝和包衣膜組成對(duì)制劑釋藥行為的影響進(jìn)行了考察，并采用相似因子（f2）進(jìn)行相似性判定（f2值越接近100，相似程度越高；f2值介于50～100之間，釋藥行為無(wú)顯著性差異；f2值小于50時(shí)，則認(rèn)為釋藥行為有顯著性差異）。

基本處方暫定如下：

片芯組成：SRL固體分散體（含SRL 9%）1.1 g，PEO 3.0 g，乳糖 8.5 g，硬脂酸鎂 0.07 g。包衣液組成：CA 1.0 g，PEG4000.15 g，丙酮-水（95∶5）100 mL。共制100片（衣膜增重為10 mg）。

2.3.1 PEO分子量對(duì)藥物釋放的影響。難溶性藥物SRL在片芯微環(huán)境內(nèi)難以完全溶解釋出，故加入低分子量PEO作為釋藥載體，以避免水化后SRL沉淀析出。試驗(yàn)中選擇Mw20000、Mw30000、Mw400003種低分子量PEO，其余輔料組成見(jiàn)基本處方，按“2.2”項(xiàng)下方法制備控釋片，考察PEO分子量對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，不同分子量PEO對(duì)藥物釋放有顯著性影響。隨著分子量的增大，藥物釋放減慢。其中Mw20000既能達(dá)到良好的釋藥效果，又能有效避免釋藥過(guò)程中衣膜可能出現(xiàn)的膨脹變形現(xiàn)象。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 自制片劑相似性分析Tab 1 Similarity analysis of self-prepared tablets

2.3.2 PEO用量對(duì)藥物釋放的影響。選用PEO Mw20000為釋藥載體，用量分別為20、30、40 mg，制備控釋片，考察不同用量對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，在考察范圍內(nèi)，PEO用量對(duì)藥物釋放無(wú)顯著性影響。但隨著PEO用量的增加，藥物釋放速率有減慢趨勢(shì)。故選擇PEO用量為30 mg。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.3 促滲劑種類(lèi)對(duì)藥物釋放的影響。由于藥物產(chǎn)生的滲透壓較低，一般需加入促滲劑以產(chǎn)生足夠滲透壓來(lái)維持適宜的釋藥速率。選擇乳糖、甘露醇、NaCl 3種不同促滲劑，其用量均為85 mg，制備控釋片，考察促滲劑種類(lèi)對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，不同促滲劑對(duì)藥物釋放有影響，其釋藥速率快慢依次為NaCl＞乳糖＞甘露醇。故選擇NaCl作為促滲劑。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.4 促滲劑用量對(duì)藥物釋放的影響。取NaCl用量分別為55、85、115 mg，制備控釋片，考察不同用量的NaCl對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，促滲劑用量對(duì)藥物釋放有顯著性影響：隨著NaCl用量的增加，藥物釋放速率加快。其中NaCl用量為115 mg時(shí)，釋藥過(guò)快；而用量為55、85 mg時(shí)釋藥效果均滿足要求，故NaCl用量為55～85 mg。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.5 片劑硬度對(duì)藥物釋放的影響。在制片過(guò)程中由于機(jī)器及其他系統(tǒng)誤差，片芯硬度可能在一定的范圍內(nèi)發(fā)生波動(dòng)。試驗(yàn)中固定主藥含量，PEO用量30 mg，NaCl用量85 mg，將片芯硬度控制在30、50、70 N 3個(gè)水平，制備控釋片，考察不同片芯硬度對(duì)藥物釋放的影響，結(jié)果表明，在考察的范圍內(nèi)片芯硬度對(duì)釋放無(wú)顯著性影響，故將片芯硬度控制在約50 N。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.6 釋藥孔大小對(duì)藥物釋放的影響。釋藥孔的大小由半透膜的性質(zhì)、厚度、藥物分子大小及釋放介質(zhì)的黏度決定。要獲得所需要的釋藥速率，必須選擇適當(dāng)?shù)尼屗幙讖健Ｔ囼?yàn)制備不同釋藥孔徑的控釋片，分別為0.6、0.8、1.0 mm，其余條件同“2.3.5”項(xiàng)，考察釋藥孔大小對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，在考察的范圍內(nèi)釋藥孔大小對(duì)藥物釋放無(wú)顯著性影響。故本試驗(yàn)選擇釋藥孔徑為1.0 mm。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.7 PEG分子量對(duì)藥物釋放的影響。CA單獨(dú)使用形成的薄膜包衣往往機(jī)械性能差，較脆易斷裂。為改進(jìn)衣膜質(zhì)量，常在包衣處方中添加增塑劑以提高包衣材料的成膜能力，增強(qiáng)包衣膜在室溫時(shí)的柔韌性和抗撞擊強(qiáng)度，改善衣膜對(duì)底物的黏附狀態(tài)，以獲得具有良好控釋能力的包衣膜。參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，選擇同時(shí)具有增塑劑和致孔劑作用的水溶性PEG，試驗(yàn)考察不同分子量PEG（400、4000）對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，PEG分子量對(duì)藥物釋放有顯著性影響：PEG分子量越大，釋藥速率越慢。故本試驗(yàn)選擇PEG分子量為400。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.8 PEG400用量對(duì)藥物釋放的影響。選擇相當(dāng)于CA用量的5%、10%、15%的PEG400，制備控釋片，考察不同PEG400用量對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果表明，PEG400用量對(duì)藥物釋放有顯著性影響：隨著PEG400用量的增大，釋藥速率明顯加快。其中PEG400用量為15%時(shí)，釋藥過(guò)快，故選擇PEG400用量為10%～15%。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.9 衣膜增重對(duì)藥物釋放的影響。由于衣膜較薄，無(wú)法直接測(cè)量其衣膜厚度，故本文采用衣膜增重法測(cè)定，方法如下：W＝（W2－W1）/n，式中W為衣膜增重（mg），W1為包衣前n片片芯的重量（mg），W2為包衣后n片片劑的重量（mg）。

滲透泵的釋藥速率與包衣膜厚度關(guān)系密切。衣膜厚度應(yīng)適中，膜過(guò)薄則牢度不夠，一旦破裂，藥物迅速傾瀉而出，有可能引起藥物過(guò)量的危險(xiǎn)；膜過(guò)厚則難以將釋藥速率調(diào)整到產(chǎn)生持續(xù)有效血濃度的釋藥水平。選擇衣膜增重分別為10、15、20 mg，制備控釋片，考察衣膜增重對(duì)藥物釋放的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。采用f2法進(jìn)行相似性判定，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 衣膜增重對(duì)藥物釋放的影響（n＝3）Fig 1 Effect of weight gain of coating film on drug release（n＝3）

由圖1可見(jiàn)，隨著衣膜增重的增加，釋藥速率明顯減慢。其中衣膜增重為20 mg時(shí)，釋藥過(guò)快，故選擇衣膜增重為10～15 mg。

2.4 正交試驗(yàn)

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素考察的基礎(chǔ)上確定了進(jìn)行正交試驗(yàn)的因素及其水平。固定主藥含量，PEO用量為每片30 mg，片芯硬度約為50 N，釋藥孔徑為1.0 mm。選擇對(duì)藥物釋放影響較大的3個(gè)因素即NaCl用量（A）、衣膜增重（B）以及PEG400用量（C）作為影響因素，每個(gè)因素分為3個(gè)水平，詳見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Tab 2 Factors and levels of orthogonal experiment

2.4.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇[7，8]。緩控釋制劑的釋放度評(píng)價(jià)指標(biāo)有很多種，如：采用零級(jí)釋放的相關(guān)系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)；對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，再對(duì)得到的模型方程進(jìn)行評(píng)價(jià)；其它如偏離度、相似因子等都可以作為緩控釋制劑的釋放度評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)擬選用相關(guān)系數(shù)r為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)方法如下：將各取樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)累積釋放度與時(shí)間按零級(jí)釋藥方程進(jìn)行擬合，以方程的r作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。公式為：Mt/M∞＝kt，式中，Mt為t時(shí)刻的藥物釋放量，M∞為最大藥物釋放量，k是藥物釋放速度常數(shù)。最后采用直觀分析的方法，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.4.3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。具體試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal experiment

由表3可知，以r為指標(biāo)時(shí)，各因素影響的大小次序?yàn)椋築＞C＞A，最優(yōu)處方為A2B2C2，即NaCl的用量為70 mg，衣膜增重為12 mg，PEG400的用量為CA用量的12%。

2.5 處方確定

制劑最終處方確定如下：

片芯組成：SRL固體分散體（含SRL 9%）1.1 g，PEO 3.00 g，NaCl 7.00 g，硬脂酸鎂 0.07 g。包衣液組成：CA 1.20 g，PEG4000.14 g，丙酮-水（95∶5）100 mL。共制100片（衣膜增重為12 mg）。

按上述處方制備樣品，其體外釋藥曲線見(jiàn)圖2；并進(jìn)行釋藥方程擬合，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖2 優(yōu)化處方的體外釋放曲線（n＝6）Fig 2 Drug release curves in vitro of optimized formulation（n＝6）

表4 釋藥曲線擬合方程表Tab 4 Fitting equations of drug release curve

由表4可知，本制劑體外釋藥方程更符合零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程（r＝0.9954）。

3 討論

3.1 片芯處方對(duì)釋藥的影響

一般認(rèn)為單層滲透泵片的釋藥機(jī)制是滲透、溶脹共同作用機(jī)制，二者同等重要[9]。（1）藥物及促滲劑（NaCl等）形成較大的滲透壓，單層滲透泵片源源不斷地從外部環(huán)境吸進(jìn)水分；（2）在助懸劑（PEO等）的溶脹作用下，難溶性藥物粉末形成穩(wěn)定的混懸液，并從釋藥孔釋放。由本試驗(yàn)結(jié)果也可以看到，助懸劑和促滲劑的加入對(duì)于藥物的釋放行為有顯著性影響。

3.2 包衣膜處方對(duì)釋藥的影響

包衣膜因素包括衣膜對(duì)水分的通透系數(shù)、包衣膜厚度等。衣膜中加入親水性高分子材料可以增加衣膜對(duì)水分的通透系數(shù)，從而增加釋藥速率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，衣膜厚度增加會(huì)減小衣膜水分通透性，減小釋藥速度；親水性高分子材料PEG400用量越大，藥物釋放越快。這可能是由于：（1）PEG400經(jīng)瀝出后能在衣膜中形成可供藥物通過(guò)的孔道；（2）PEG400瀝出后形成并不相通的孔道，相當(dāng)于降低了衣膜的厚度，增加了衣膜對(duì)水的滲透性；（3）PEG400通過(guò)氫鍵等作用，增加了衣膜表面與水結(jié)合的活性部位，使衣膜的水合作用增強(qiáng)，改善衣膜的通透性，進(jìn)而加速藥物的釋放。通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，衣膜厚度及性質(zhì)是控制釋藥速率的主要因素。因此，對(duì)同一處方應(yīng)嚴(yán)格控制好衣膜增重，以獲得良好的重現(xiàn)性。

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