茅根炭止血機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究

徐丹洋， 馬長振， 陳佩東， 張 麗， 李 嫻， 丁安偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)、江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046）

白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindrical（Beauv.）干燥的根。為中醫(yī)臨床常用中藥，具有涼血止血、清熱利尿的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，白茅根還具有抗炎［1］、鎮(zhèn)痛［2］、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)［3］等作用。白茅根炮制后成為茅根炭，止血作用增強(qiáng)，是中醫(yī)臨床著名止血方藥十灰散中的一味。目前關(guān)于茅根炭止血機(jī)理的研究報道較少，宋勁詩［4］等通過研究表明，茅根炭和白茅根都能夠明顯縮短小鼠出血時間以及增強(qiáng)血小板聚集率，但是茅根炭的作用更強(qiáng)。血液凝固是一個復(fù)雜的系統(tǒng)過程，主要的影響因素有凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)和血小板聚集。本實(shí)驗(yàn)將針對這三個因素，分別選取相應(yīng)的指標(biāo)測試茅根炭以及前期實(shí)驗(yàn)［5］中篩選出的鞣質(zhì)和乙酸乙酯兩個活性部位對它們的影響，以期能夠從多方面揭示茅根炭止血的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 大鼠（SD種），♂性，體重（200±20）g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號:SCXK（浙）2003－0001。

1.2 藥品與試劑 云南白藥（批號:20080209）:購自云南白藥集團(tuán)股份有限公司;CMC－Na（批號:F20010518）:購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司;膠原（批號:117K3781）:購自Sigma公司;體外診斷試劑盒:凝血酶時間（TT、批號:STG10301－25）、凝血酶原時間（PT、批號:STG20102－36）、活化部分凝血活酶時間（APTT、批號:ST20201－29）、纖維蛋白原含量（FIB、批號:STG20401－23）、4，5－腺苷二磷酸二鈉鹽（ADP），均購自北京世帝科學(xué)儀器公司。ELISA試劑盒:血栓素 B2（TXB2）:（批號:LN11017110025）、6－酮－前 列 腺 素 F1α（6－keto－PGF1α）:（批號:LN11017110025）、大鼠組織型纖溶酶原激活物（t－PA）:（批號:LN11017110025）、大鼠組織型纖溶酶原激活物抑制劑（PAI－1）:（批號:LN11017110025），均購自武漢中美科技有限公司。

白茅根飲片購自南京藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為禾本科植物白茅Imperata cylindrica（Beauv.）的干燥根莖（批號:080214）。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀（Bio－Rad公司，680型）、血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司，LGPABER）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，Anke LXJIIB）、電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，YP601N）。

1.4 供試品制備 云南白藥供試液配制:云南白藥臨床用量為2 g/60 kg，實(shí)驗(yàn)動物按臨床用量20倍給藥，即0.667 g/kg。取云南白藥粉末6.67 g加入0.5%CMC－Na 200 mL研磨均勻即得云南白藥供試品液。

白茅根炭品供試液配制:取適量生品白茅根，310℃炒制4 min［5］至黑褐色，制成白茅根炭品。粉碎后過160目篩。因其臨床（十灰散）用量為9 g/60 kg，經(jīng)過換算后即取白茅根炭粉末30 g，加入200 mL 0.5%CMC－Na溶液混勻即得炭品供試品液。

白茅根生品供試液配制:取生品白茅根粉末35.7 g（相當(dāng)于茅根炭粉30 g）加入200 mL 0.5%CMC－Na溶液混勻即得生品供試品液。

白茅根炭鞣質(zhì)供試液配制:取30 g白茅根炭粉末，按2005版《中國藥典》中鞣質(zhì)的提取方法進(jìn)行提取，將提取液濃縮到1 g/mL后加入0.5%CMCNa溶液制成相當(dāng)于0.15 g/mL炭品的供試品液，即得茅根炭鞣質(zhì)供試品液。

白茅根炭乙酸乙酯供試液配制:取適量白茅根炭粉末，以70%乙醇回流提取2次，回收乙醇，揮至無醇味，蒸餾水溶解，用乙酸乙酯少量多次萃取，回收乙酸乙酯得浸膏（得率2.8%）。取0.84 g浸膏（相當(dāng)于30 g茅根炭粉）加入200 mL 0.5%CMCNa溶液研勻，即得供試品液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對 PT、TT、APTT、FIB影響的測定［6］取大鼠（SD種）60只，♂性，體重（200±20）g，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白對照組（0.5%CMCNa），陽性對照組（云南白藥），茅根生品組，茅根炭品組，茅根炭鞣質(zhì)組，茅根炭乙酸乙酯組。按2 mL/100 g每天灌胃給藥1次，連續(xù)10 d。于第10天給藥1 h后，頸總動脈插管取血，放入加有枸櫞酸鈉（3.8%）的離心管內(nèi)（抗凝劑與血液比例:1∶9），搖勻，血液標(biāo)本放置不超過3 h，以3 000 r/min離心10 min，分離血漿。按各指標(biāo)試劑盒的要求進(jìn)行凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血漿纖維蛋白原（FIB）的測定。

2.2 血小板聚集功能的測定 取大鼠（SD種）60只，♂性，體重（200±20）g，分組及給藥方法同上。于第10天給藥1 h后，頸動脈插管取血，放入加有枸櫞酸鈉（3.8%）的離心管內(nèi)，搖勻。以800 r/min離心10 min，取上層液即為富血小板血漿（PRP）;余下部分再以3 000 r/min離心10 min，取上清液即為貧血小板血漿（PPP）［7］。按 Born 比濁法［8］測定血小板最大聚集率。

2.3 TXB2、6－keto－PGF1α、t－PA 和 PAI－1 的測定 取大鼠（SD種）60只，♂性，體重（200±20）g，分組及給藥方法同上。于末次給藥1 h后，頸動脈插管取血，加入放有肝素（1%）溶液的離心管內(nèi)抗凝。以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作，用 ELISA 法，測定 TXB2、6－keto－PGF1α、tPA 和 PAI－1 的含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 統(tǒng)計采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各供試品對大鼠PT、TT、APTT、FIB的影響與空白對照組比較，茅根炭品組，茅根炭乙酸乙酯組均能顯著縮短大鼠凝血酶時間和凝血酶原時間。而炭品鞣質(zhì)組和生品組對兩者則沒有影響。結(jié)果見表1。

表1 各組供試品對大鼠PT和TT的影響（±s，n=10）

表1 各組供試品對大鼠PT和TT的影響（±s，n=10）

注:與空白對照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/（g/kg）PT/s TT/s空白對照 － 17.30±1.31 37.30±3.60云南白藥 0.667 14.82±1.00** 35.72±1.55白茅根生品 3.00 16.47±1.23 36.61±3.64白茅根炭品 3.00 15.36±1.00** 34.05±2.24*白茅根炭鞣質(zhì) 3.00 17.05±1.52 35.66±2.11白茅根炭乙酸乙酯 3.00 15.87±1.46* 33.95±2.96*

與空白對照組比較，茅根炭品組，鞣質(zhì)組，乙酸乙酯組均能明顯縮短大鼠的活化部分凝血活酶時間。同時茅根炭品組和鞣質(zhì)組還能夠增加提高血液中纖維蛋白原的含量。結(jié)果見表2。

表2 各組供試品對大鼠APTT和FIB 的影響（±s，n=10）

表2 各組供試品對大鼠APTT和FIB 的影響（±s，n=10）

注:與空白對照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/（g/kg） APTT/s FIB/（g/L）空白對照 － 14.39±1.91 3.17±1.08云南白藥 0.667 13.61±1.14 4.87±0.77＊＊白茅根生品 3.00 13.12±2.27 3.76±0.19白茅根炭品 3.00 12.29±2.40* 4.33±0.02＊白茅根炭鞣質(zhì) 3.00 12.07±0.78** 4.26±0.14＊白茅根炭乙酸乙酯 3.00 12.48±1.69*3.88±0.73

3.2 各組供試品對大鼠血小板聚集率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茅根炭品組均明顯提高ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚率;茅根炭乙酸乙酯組對兩者誘導(dǎo)的血小板聚集均無明顯促進(jìn)作用。茅根炭鞣質(zhì)組能顯著提高ADP誘導(dǎo)的血小板聚集（P＜0.01），但對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集功能的影響不顯著。結(jié)果見表3。

表3 各組供試品對ADP和Coll誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率的影響（±s，n=10）

表3 各組供試品對ADP和Coll誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率的影響（±s，n=10）

注:與空白對照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/（g/kg）ADP最大聚集率/%膠原最大聚集率/%空白對照 —46.31±8.82 45.97±5.09云南白藥 0.667 59.14±5.13** 53.54±7.17*茅根生品 3.00 50.67±7.82 41.58±5.71茅根炭品 3.00 54.97±5.85* 52.51±5.53*茅根炭鞣質(zhì) 3.00 60.61±9.63** 50.98±5.88茅根炭乙酸乙酯3.00 52.17±5.91 49.07±4.07

3.3 各組大鼠 TXB2和6－keto－PGF1α的含量 與空白對照組比較，茅根炭鞣質(zhì)組能夠明顯提高TXB2的含量而降低6－keto－PGF1α的含量。茅根炭乙酸乙酯組對TXB2含量的提高沒有顯著影響，但能顯著降低6－keto－PGF1α的含量。而炭品組對兩者的含量沒有顯著影響。結(jié)果見表4。

表4 各組供試品對大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α含量的影響（±s，n=10）

表4 各組供試品對大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α含量的影響（±s，n=10）

注:與空白對照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/（g/kg）TXB2/（pg/mL） 6－keto－PGF1α/（pg/mL）空白對照 —26.89±14.30 12.08±5.19云南白藥 0.667 45.77±14.59* 5.61±2.90*茅根生品 3.00 35.08±8.36 20.08±11.14茅根炭品 3.00 44.00±12.91 6.34±3.68茅根炭鞣質(zhì) 3.00 57.90±26.06* 6.15±1.56*茅根炭乙酸乙酯 3.00 40.43±19.83 2.48±1.34**

3.4 各供試品對大鼠組織型纖溶酶原激活劑（t－PA）與纖溶酶原激活物抑制劑（PAI－1）的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茅根各供試品溶液對大鼠纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活物抑制劑的含量沒有影響。結(jié)果見表5。注:與空白對照比:*P＜0.05，**P＜0.01。

表5 各供試品對大鼠t-Pa和PAI-1的影響（±s，n=10）

表5 各供試品對大鼠t-Pa和PAI-1的影響（±s，n=10）

組別 劑量/（g/kg）纖溶酶原激活劑/（IU/mL）纖溶酶原激活物抑制劑/（IU/mL）空白對照 —0.35±0.07 0.04±0.03云南白藥 0.667 0.24±0.01 0.16±0.12*茅根生品 3.00 0.38±0.08 0.03±0.01茅根炭品 3.00 0.32±0.05 0.08±0.09茅根炭鞣質(zhì) 3.00 0.36±0.09 0.06±0.06茅根炭乙酸乙酯3.00 0.41±0.02 0.04±0.03

4 討論

4.1 凝血過程是復(fù)雜的，醫(yī)學(xué)上常用瀑布流學(xué)說來解釋凝血機(jī)理。簡單的瀑布流學(xué)說就是凝血有內(nèi)源性、外源性途徑和四個關(guān)鍵步驟，即:（1）啟動;（2）血液凝血活酶形成;（3）凝血酶形成;（4）形成穩(wěn)定的纖維蛋白。所以本實(shí)驗(yàn)選擇了PT、TT、APTT、FIB四個指標(biāo)來研究茅根炭及其有效部位對凝血系統(tǒng)的作用，既能反映內(nèi)源性（主要通過APTT反映）、外源性（主要通過PT反映），又能反映其關(guān)鍵的四個步驟（PT、TT、APTT、FIB 四個指標(biāo)共同反映）。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，茅根炭對大鼠凝血系統(tǒng)的四個指標(biāo)均有顯著的作用，說明茅根炭既能影響外源性途徑也能影響內(nèi)源性途徑，達(dá)到增強(qiáng)止血作用的效果，但是對外源性凝血途徑的影響更大一些（P＜0.01）。茅根炭鞣質(zhì)部位主要是通過影響內(nèi)源性凝血因子和纖維蛋白原來達(dá)到增強(qiáng)止血作用的效果，而乙酸乙酯部位除了對纖維蛋白原沒有影響外，對其它內(nèi)外源性凝血系統(tǒng)都有影響。

4.2 本實(shí)驗(yàn)選擇了血小板聚集率以及血栓素B2（TXB2）、6－酮－前列腺素 F1α（6－keto－PGF1α）作為指標(biāo)來研究各供試品對血小板聚集的影響。血小板的吸附、聚集作用在止血初期具有重要意義。血小板聚集在人類可觀察到二個聚集時相。第一相聚集是由ADP或Adr等直接作用于血小板而發(fā)生的，第二相聚集則是由于ADP、Adr或Coll等刺激血小板釋放內(nèi)源性ADP和TXA2等再次作用于血小板而引起的聚集［9］。茅根炭品對ADP和Coll誘導(dǎo)的第一相聚集和第二相聚集均有促進(jìn)作用。而茅根炭鞣質(zhì)組則只對ADP誘導(dǎo)的第一相聚集有作用但作用強(qiáng)于茅根炭（P＜0.01）。說明茅根炭作為整體通過多途徑促進(jìn)血小板聚集。

TXA2和PGI2是調(diào)節(jié)血管壁緊張性的一對重要血管活性物質(zhì)。TXA2可使血管痙攣，促進(jìn)血小板聚集和血栓形成。PGI2是內(nèi)皮細(xì)胞中花生四烯酸代謝的環(huán)氧合酶產(chǎn)物，是強(qiáng)血管擴(kuò)張劑，可抑制血小板聚集。PGI2和TXA2之間的動態(tài)平衡對維持血流動力學(xué)穩(wěn)定起重要作用，PGI2和TXA2體內(nèi)半衰期很短，可通過檢測TXA2和PGI2在血漿中的代謝產(chǎn)物TXB2和6－keto－PGF1α 的含量，來了解血漿中 TXA2和PGI2的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茅根炭對 TXB2和 6－keto－PGF1α的含量沒有影響，但是鞣質(zhì)部位則能顯著的升高TXB2的含量而降低 6－keto－PGF1α的含量。由于鞣質(zhì)部位對血小板第二相聚集沒有顯著影響，則說明其可能通過直接影響花生四烯酸的合成或代謝來影響TXB2和 6－keto－PGF1α的含量，從而促進(jìn)血小板聚集。茅根炭乙酸乙酯部位能顯著降低6－keto－PGF1α的含量，說明其可以抑制PGI2的合成。

4.3 本實(shí)驗(yàn)選擇了纖溶酶原激活劑（t－PA）和其抑制劑（PAI－1）兩個指標(biāo)來研究茅根炭各供試品對纖溶系統(tǒng)的作用。（t－PA）、（PAI－1）是纖溶系統(tǒng)的主要成分，兩者均由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，是纖溶系統(tǒng)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)，在纖溶系統(tǒng)的活化過程中占有重要的地位。兩者之間的動態(tài)平衡對維持正常的血液流動有著重要意義。兩者失衡將導(dǎo)致出血或血栓形成。

通過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，茅根炭及各供試品溶液對（t－PA）、（PAI－1）兩個指標(biāo)沒有顯著影響，說明纖溶系統(tǒng)對供試品的止血作用沒有貢獻(xiàn)。

綜上，茅根炭主要是通過影響大鼠的凝血系統(tǒng)和血小板聚集而達(dá)到增強(qiáng)止血作用的效果，而茅根炭的鞣質(zhì)或乙酸乙酯部位對大鼠凝血系統(tǒng)和血小板聚集功能呈現(xiàn)出不同的影響，說明茅根炭作為多成分的整體是通過多靶點(diǎn)來發(fā)揮療效作用的。但究竟是茅根炭中的什么成分或成分組合起作用還有待進(jìn)一步研究。隨著血栓與止血研究的快速發(fā)展，炭藥止血機(jī)理研究可以在蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、床邊凝血分析技術(shù)、生物芯片技術(shù)等領(lǐng)域進(jìn)行研究。

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