黃 華, 崔曉蘭, 王歆君, 姚 華
(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆烏魯木齊 830004;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700;3.新疆制藥廠,新疆烏魯木齊 830032)
柴銀感冒顆粒(無(wú)糖型)為衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)收載品種,是由柴胡、金銀花、大青葉、板藍(lán)根、陳皮、甘草等藥材組成的復(fù)方制劑,具有清熱解毒等功效,臨床主要用于風(fēng)熱感冒。本文通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),對(duì)柴銀感冒顆粒的抗病毒作用展開(kāi)研究,為其在臨床防治流感的應(yīng)用提供參考。
受試藥 柴銀感冒顆粒(無(wú)糖型),15 g/袋,臨床成人口服 1~2袋/次,3次/日,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025872,由新疆制藥廠提供,批號(hào)20040556;抗病毒顆粒,15 g/袋,臨床成人口服1~2袋/次,3次/日,國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020073,四川光大制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)0406027。
病毒及細(xì)胞株 甲型流感病毒(A)、乙型流感病毒(B)、柯薩奇B族病毒5型(Cox B5)、副流感病毒1型(HVJ-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(Ad-3),流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FM1),分別購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)科院病毒研究所及兒科研究所。狗腎傳代細(xì)胞株(MDCK),購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠,♀♂各半,體重(14±1)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)研究所提供,合格證 scxk(京)2002-003 號(hào)。
細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液 培養(yǎng)液含5%小牛血清、維持液含2%小牛血清。
試劑與儀器 含谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBICOL公司);DMSO、HEPES、小牛血清(中國(guó)醫(yī)科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所);L-谷氨酰胺(Sigma公司);MTT、胰蛋白酶(Amresco公司)。
BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜(蘇凈集團(tuán));HH.CP-01 型 CO2培養(yǎng)箱(上海?,敚?XDS-1B 倒置顯微鏡(南京翼飛);MDF-382E型超低溫冰箱(日本SANYO電器);SZ-96自動(dòng)純水蒸餾器(上海亞榮);DM LB/11888010型熒光顯微鏡(德國(guó)Leica)。
柴銀感冒顆粒和抗病毒顆粒均以純水配成100 mg/mL的原液,過(guò)濾除菌后備用,實(shí)驗(yàn)時(shí)按需要做倍比稀釋。
2.1.1 測(cè)定藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性
分別將原藥液用維持液稀釋成1∶4、1∶8、1∶16、…、1∶256共七個(gè)濃度,加到接種MDCK細(xì)胞并已長(zhǎng)成單層的96孔培養(yǎng)板中,100 μL/孔,每稀釋度4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。將培養(yǎng)板置37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,確定細(xì)胞不出現(xiàn)明顯退變的最低稀釋倍數(shù)為最大無(wú)毒濃度(TC0),并按 Reed-Muench法計(jì)算 50%毒性濃度(TC50),結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 對(duì)MDCK細(xì)胞的TC0和TC50的測(cè)定
2.1.2 對(duì)病毒致細(xì)胞病變(CPE)的影響
取已接種MDCK細(xì)胞并長(zhǎng)成單層的培養(yǎng)板,吸棄培養(yǎng)液,按100倍的半數(shù)組織感染劑量(TCID50)分別加入不同病毒液50 μL,置37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h后,吸棄病毒液,用不含小牛血清的Eagle’s維持液洗細(xì)胞表面2次,設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、抗病毒顆粒組和柴銀顆粒不同濃度(取TC0及其以下的3個(gè)2倍稀釋度共4個(gè)濃度)的給藥組,4孔/組。給藥組加入不同稀釋度的藥液,對(duì)照組加維持液,100 μL/孔。培養(yǎng)板置 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況,其程度按六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷,并按Reed-Muench法計(jì)算IC50和SI(TC50/IC50)。
-:細(xì)胞生長(zhǎng)正常,無(wú)病變出現(xiàn);
±:細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10%;
1:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的10% ~25%;
2:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25% ~50%以下;
3:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50% ~75%以下;
4:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上。
結(jié)果柴銀感冒顆粒對(duì)甲、乙型流感病毒、HVJ-1、Cox B5、RSV有明顯的抑制作用,其 IC50分別為457.0、676.1、347.2、537.0、562.4 μg/mL,SI分別為9.8、6.6、12.8、8.3、7.9,對(duì) Ad-3 無(wú)明顯抑制作用(表2、3)。
表2 對(duì)病毒致MDCK細(xì)胞病變程度(CPE)的影響
2.2.1 對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用
表3 對(duì)病毒致MDCK細(xì)胞病變的IC50和SI
取小鼠60只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒感染對(duì)照組、抗病毒顆粒組和3個(gè)劑量的柴銀感冒顆粒組,每組10只。除正常對(duì)照組外,將小鼠用乙醚輕度麻醉后以15LD50的FM1滴鼻感染,0.05 mL/只。感染前一天開(kāi)始按劑量灌胃給藥,每天1次,連續(xù)5 d,對(duì)照組給予等量蒸餾水(DW)灌胃。第6天各組小鼠稱(chēng)重后處死解剖,摘取全肺稱(chēng)重,計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。
結(jié)果3個(gè)劑量的柴銀感冒顆粒肺指數(shù)值均低于病毒感染對(duì)照組,其中大劑量組對(duì)FM1引起的肺炎有明顯的抑制作用(表4)。
表4 對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用(±s)
表4 對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用(±s)
與正常對(duì)照組比較,##P<0.01;與病毒感染對(duì)照組比較,*P<0.05,**P <0.01。
組別 劑量/(g/kg)動(dòng)物數(shù)/只 肺指數(shù)值 抑制率/%正常對(duì)照 — 10 0.98±0.04—27.3病毒感染對(duì)照 — 10 1.50±0.34## —抗病毒顆粒 6 10 1.17±0.24* 22.0柴銀感冒顆粒 3 10 1.27±0.40 15.3 6 10 1.25±0.32 16.7 12 10 1.09±0.16**
2.2.2 對(duì)流感病毒所致小鼠死亡的保護(hù)作用
取小鼠100只,隨機(jī)分為病毒感染對(duì)照組、抗病毒顆粒組和三個(gè)劑量的柴銀感冒顆粒組,每組20只。各給藥組按劑量灌胃給藥,每天1次,連續(xù)7 d,病毒對(duì)照組給予等量的蒸餾水。給藥第2天各組小鼠用乙醚輕度麻醉后,F(xiàn)M1病毒液取感染后死亡率超過(guò)90%的濃度2LD50滴鼻感染,每只0.05 mL。記錄感染后小鼠的死亡情況,計(jì)算死亡保護(hù)率及生命延長(zhǎng)率。
結(jié)果在感染病毒后15 d內(nèi),各給藥組小鼠死亡率均低于感染對(duì)照組,存活時(shí)間較感染組延長(zhǎng),柴銀感冒顆粒中、大劑量保護(hù)作用明顯,死亡保護(hù)率分別為21.1%、31.6%,生命延長(zhǎng)率為17.8%和22.5%(表5)。
表5 對(duì)流感病毒致小鼠死亡的保護(hù)作用
2.2.3 對(duì)小鼠肺內(nèi)流感病毒增殖量的影響
取小鼠50只,隨機(jī)分為病毒感染組、抗病毒顆粒組和3個(gè)劑量的柴銀顆粒組,每組10只。各給藥組動(dòng)物按劑量灌胃給藥,2次/d,連續(xù)3 d。對(duì)照組給等量的蒸餾水。于給藥第2天各組動(dòng)物以1000LD50滴鼻感染 FM1,0.05 mL/只,48 h 后處死動(dòng)物,摘取左肺中葉固定,常規(guī)脫水、包埋、制作石蠟切片,間接熒光染色,觀察計(jì)數(shù)肺內(nèi)熒光顆粒,判斷藥物對(duì)病毒增殖的影響。
結(jié)果3個(gè)劑量的柴銀顆粒組肺內(nèi)病毒增殖量均明顯低于病毒對(duì)照組,表明柴銀顆粒對(duì)小鼠肺內(nèi)流感病毒的增殖有顯著的抑制作用(表6)。
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,柴銀感冒顆粒體外給藥可抑制甲型、乙型流感病毒、副流感病毒等呼吸病毒所導(dǎo)致的細(xì)胞病變;對(duì)流感病毒感染小鼠有明顯的保護(hù)作用,可降低死亡率并延長(zhǎng)小鼠生存期;對(duì)小鼠流感病毒性肺炎有明顯的抑制作用,并可抑制小鼠肺內(nèi)流感病毒的增殖。
表6 柴銀顆粒對(duì)小鼠肺內(nèi)流感病毒增殖量的影響(±s)
表6 柴銀顆粒對(duì)小鼠肺內(nèi)流感病毒增殖量的影響(±s)
與病毒感染對(duì)照組比較,**P<0.01。
組別 劑量/(g/kg) 終樣本數(shù)/動(dòng)物數(shù)/只 檢查總數(shù)/個(gè) 陽(yáng)性數(shù)/個(gè) 陽(yáng)性率/% 抑制率/%病毒感染對(duì)照 —9/10 238 101 41.8±8.5 0抗病毒顆粒 6 9/10 218 50 22.9±6.2** 45.3柴銀感冒顆粒 3 9/10 234 62 30.7±6.4** 26.7 6 9/10 214 60 28.9±9.3** 32.5 12 9/10 228 70 26.2±5.8**37.5
傳統(tǒng)中藥在防治流感方面有其獨(dú)道之處,許多解表藥、清熱藥和以它們?yōu)橹鹘M方的中成藥可通過(guò)抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、解熱抗炎等途徑起到抗流感作用[1]。如單味藥中,柴胡的水提液及揮發(fā)油對(duì)流感病毒有顯著的抑制作用[1,2];金銀花水提液可抑制流感病毒致細(xì)胞病變作用[1,2],降低流感病毒感染小鼠的死亡率,并降低鼠肺中病毒血凝素的效價(jià)[1];板藍(lán)根水提液在體外雞胚試驗(yàn)中可抑制流感病毒的增殖,并抑制流感病毒致人胚腎原代細(xì)胞的病變[1,2]。這些單味藥經(jīng)過(guò)配伍或組成復(fù)方后,抗病毒范圍可能互補(bǔ)、擴(kuò)大甚至協(xié)同[1]。本文對(duì)柴銀感冒顆粒的研究證實(shí)該復(fù)方制劑對(duì)流感病毒等多種呼吸道病毒均有良好的抗病毒作用,為其在臨床用于防治病毒性感冒提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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