HPLC同時測定苦參不同年份、不同部位中3個生物堿的含量

徐石穩(wěn)， 楊小生，*， 靳如義， 馬 琳

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550002;2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550002;3.貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，貴州貴陽 550018）

苦參（Sophora flavescensAit.）系豆科植物苦參的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功能。用作苦味健胃劑、利尿劑、消炎藥、止瀉藥和驅(qū)蟲藥。其制劑苦參凝膠系國家食品藥品監(jiān)督管理局2005年批準上市的新藥，它由原料藥苦參總堿與基質(zhì)卡波姆940等輔料經(jīng)現(xiàn)代工藝加工成的棕色透明膠凍狀半固體水溶性凝膠，具抗菌消炎之功效，用于宮頸糜爛、赤白帶下和滴蟲性陰道炎及陰道霉菌感染等婦科慢性炎癥［1］。苦參在傳統(tǒng)中藥中以根作為入藥部位，苦參的地上部分，也稱為苦參草為貴州少數(shù)民族用藥［2］。文獻報道，苦參蘆頭（根莖）和根均含有苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿［3］，我們的前期工作也獲得了結(jié)果。對苦參生物堿在苦參不同部位高效液相色譜法（HPLC）同時測定方法尚未見報道。本實驗利用HPLC同時測定了苦參不同年份、不同部位中槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿的的含量，該方法簡便、快速、準確、重復(fù)性好?；惫麎A在莖葉中含量最高，槐定堿和氧化苦參堿的含量在根中最高，且3種生物堿成分均隨年份的增長含量呈上升的趨勢，氧化苦參堿在根中的變化尤為明顯。研究結(jié)果對苦參藥材質(zhì)量評價及苦參全草的有效開發(fā)利用具有重要的參考價值。

1 儀器與材料

儀器HP1100型高效液相色譜儀 （在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器，ChemStation色譜工作站）。

槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿對照品自制，通過MS、NMR鑒定其結(jié)構(gòu)，并經(jīng)HPLC檢測純度大于98%。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純?？鄥⑺幉牟勺再F陽新天藥業(yè)羊昌苦參藥材基地。結(jié)構(gòu)鑒定如下:

化合物1:白色晶體（丙酮），mp 55～57℃。EIMS m/z:246［M+］，245（M－1），217，203，177，150，122，96。1H－NMR（CDCl3，400 MHz，下同）δ:6.47（1H，ddd，J=9.8，5.0，3.8 Hz H－13），5.81（1H，d，J=10.0 Hz，H－14），4.13（1H，dd，J=13.2，4.8 Hz，H－17a），3.98（1H，q，H－11），3.19（1H，t，J=13.2 Hz，H－17β），2.85（2H，m，H－2β，10β），2.62（1H，m，H－6）。13C－NMR（CDCl3，100 MHz，下同）δ:57.1（C－2），20.8（C－3），27.1（C－4），34.4（C－5），63.4（C－6），41.2（C－7），26.3（C－8），20.5（C－9），57.1（C－10），51.3（C－11），27.5（C－12），137.4（C－13），124.4（C－14），165.5（C－15），41.8（C－17）。以上數(shù)據(jù)和文獻［4－7］報道一致，確定該化合物為槐果堿（sophocarpine）。

化合物2:白色晶體（丙酮），mp 102～103℃。EI－MS m/z:248［M+］，247（M－1），233，219，205，192，177，162，150，136，122，110，96，83，69，55，41。1H－NMR（CDCl3）δ:3.30 ～3.46（3H，m，H－11，17），2.78－2.89（2H，m，H－2，10a），2.16 ～2.40（H－2，10β，14）。13C－NMR（CDCl3）δ:55.6（C－2），21.4（C－3），23.5（C－4），30.7（C－5），63.2（C－6），40.8（C－7），30.1（C－8），21.6（C－9），50.2（C－10），55.8（C－11），28.0（C－12），18.8（C－13），32.4（C－14），170.0（C－15），47.5（C－17）。以上數(shù)據(jù)與文獻［6，8］報道一致，確定其結(jié)構(gòu)為槐定堿（sophoridine）。

化合物3:白色晶體（丙酮），mp 210～211℃。EI－MS m/z:264 ［M+］，248，247，231，218，205，190，176，162，150，138，120，108，96，84，68，55，41。1H－NMR（CDCl3）δ:5.08（1H，dt，J=8.8，3.6 Hz，H－11），4.36（1H，dd，J=12.4，5.2 Hz，H－17β），4.18（1H，t，J=12.4 Hz，H－17α），3.06（5H，m，H－2α，2β，6，10α，10β），2.75（2H，m，H－3β，9β），2.41（1H，m，H－14β），2.22（2H，m，H－14α，H－12β），2.11（1H，m，H－8β）。13C－NMR（CDCl3）δ:69.3（C－2），17.2（C－3），26.1（C－4），34.5（C－5），67.3（C－6），42.7（C－7），24.8（C－8），17.3（C－9），69.6（C－10），53.0（C－11），28.5（C－12），18.7（C－13），32.9（C－14），170.3（C－15），41.9（C－17）。以上數(shù)據(jù)與文獻［5，7，9］一致，確定其結(jié)構(gòu)為氧化苦參堿（oxymatrine）。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:大連依利特分析儀器有限公司 Hypersil NH2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫:26℃;流動相:乙腈－3%磷酸溶液－無水乙醇（82 ∶8 ∶10）;流速:1 mL/min;進樣量:5 μL;檢測波長:220 nm。按上述色譜條件獲得對照品和樣品的色譜圖（見圖1）。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿，用乙腈－無水乙醇（80∶20）制成槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿濃度分別為0.009 98、0.050 15、0.150 75 mg/mL 的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 按中國藥典2005版一部的方法，取苦參樣品粉末（過三號篩），同時另取本品粉末測定水分（2005版中國藥典一部水分測定第一法），精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，加濃氨水0.5 mL，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5mL，通過中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內(nèi)徑1 cm），依次以三氯甲烷、三氯甲烷－甲醇（7∶3）各20 mL洗脫，收集全部洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加流動相溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得［10］。

2.4 標準曲線和線性范圍 取混合對照品溶液，自動進樣0.5、1、3、5、7、9、11、13、15 μL，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品進樣質(zhì)量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程?；惫麎A:Y=1 021.837 1X－0.035 6，r=0.999 9;槐定堿:Y=448.016 8X－1.116 8，r=0.999 9;氧化苦參堿:Y=551.250 1X－1.368 6，r=0.999 9。結(jié)果表明槐果堿在進樣質(zhì)量為0.004 99 ～0.149 7 μg，槐定堿在0.025 08 ～0.752 25 μg，氧化苦參堿在0.075 38 ～2.261 25 μg時，與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算。槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿RSD值分別為0.63%、0.95%、1.03%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取3年生莖葉的樣品，按2.3項下方法平行制備5份供試品溶液，在同一色譜條件下測定。樣品中槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿的RSD分別為0.77%、0.67%、2.11%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，測定峰面積，槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿RSD分別為2.04%、2.05%、1.81%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 取苦參對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷溶解，制成槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿濃度分別為 0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.15 mg/mL的混合對照品溶液。取已知含量的2年生苦參莖葉粉末6份各0.25 g，精密稱定，分別精密加入上述對照品溶液10 mL，置具塞錐形瓶中，加濃氨水0.5 mL，精密加入三氯甲烷10 mL，密塞，稱定重量，從“超聲處理……”起，按2.3項下方法制備所需溶液。依法測定，計算回收率?；惫麎A，槐定堿，氧化苦參堿的平均回收率分別為99.91%，99.26%，100.27%;RSD分別為1.11%，0.82%，2.18%。

2.9 樣品測定 取不同年份，不同部位的苦參藥材，按供試品溶液制備項下方法制備供試液，按上述色譜條件測定，計算含量。結(jié)果見表1。

圖1 對照品（A）和樣品（B）1.槐果堿 2.槐定堿 3.氧化苦參堿Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）1.sophocarpine 2.sophoridine 3.oxymatrine

表1 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.1 Result of content determination of samples

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗比較了流動相乙腈－無水乙醇－3%磷酸溶液（80 ∶10 ∶10）［11］、（81 ∶10 ∶9）和（82∶10∶8）的分離情況，最后選擇乙腈－無水乙醇－3%磷酸溶液（82∶10∶8）為流動相，能使不同年份、不同部位苦參莖葉、蘆頭和根中多個生物堿成分得到基線分離，此方法簡便易行，重現(xiàn)性好。

3.2 實驗結(jié)果 不同年份、不同部位苦參莖葉、蘆頭和根中槐果堿的含量分布狀態(tài)為莖葉＞根＞蘆頭，槐定堿的含量分布狀態(tài)為根＞莖葉＞蘆頭，氧化苦參堿的含量分布狀態(tài)為根＞蘆頭＞莖葉，而且3種生物堿類成分均隨年份的增長含量呈上升的趨勢。

3.3 實驗結(jié)果顯示，不同年份，不同部位，3種生物堿的含量分布存在較大差異。由于苦參生長周期長，產(chǎn)量有限，如果以獲得生物堿類成分為目的，可以考慮使用苦參莖葉和蘆頭作為入藥部位。其中可考慮將槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿作為苦參莖葉、蘆頭質(zhì)量控制指標成分。本研究建立的HPLC法測定苦參莖葉、蘆頭的槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿的方法簡便、可靠，可用于苦參莖葉、蘆頭的含量測定?？煽紤]在傳統(tǒng)用藥的基礎(chǔ)上開發(fā)新的藥用部位。

3.4 目前以苦參根作為苦參凝膠原料藥苦參總堿提取的來源，而大量的地上部分莖葉和蘆頭未被利用，實驗結(jié)果顯示幾個有效成分的含量不低，特別是苦參蘆頭中生物堿的含量，可考慮將苦參莖葉和蘆頭作為苦參總堿加工提取的來源。

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