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      人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的初步研究

      2010-06-14 01:36:36王彥錢德儉尉真陸峻泓張文杰崔磊曹誼林
      組織工程與重建外科雜志 2010年2期
      關(guān)鍵詞:胚體管狀培養(yǎng)皿

      王彥 錢德儉 尉真 陸峻泓 張文杰 崔磊 曹誼林

      血管再生在骨創(chuàng)傷后組織修復(fù)中占有舉足輕重的地位。人的血管發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過程,包括:血管形成(Vasculogenesis),由未分化的胚胎干細(xì)胞分化為成血管細(xì)胞(Angioblast),再形成內(nèi)皮細(xì)胞,彼此連接組成血管;血管新生或芽殖(Angiogenesis),由已形成的微血管內(nèi)皮細(xì)胞沖破管壁的基質(zhì),遷移、增殖和連接組成新的血管[1]。這兩種方式在胚胎發(fā)育過程中均有出現(xiàn),且時(shí)間上往往交錯(cuò)進(jìn)行。而成體創(chuàng)傷后,組織修復(fù)中血管的發(fā)生主要是芽殖方式。近年來,組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展給骨創(chuàng)傷后組織修復(fù)的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供了新的思路。

      人胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ES)具有向三個(gè)胚層分化的潛能,是研究人胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的理想模型。隨著人ES細(xì)胞系的建立,應(yīng)用人ES細(xì)胞研究內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生和血管形成成為可能[2-7]。我們將來源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的ES細(xì)胞,以含維甲酸(Retinoic acid,RA)的培養(yǎng)液經(jīng)懸浮培養(yǎng),形成擬胚體(Embryonic body,EB),再將 EB 貼壁,換含TGF-β1的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),形成內(nèi)皮細(xì)胞。該方法為研究骨創(chuàng)傷修復(fù)中內(nèi)皮細(xì)胞和血管發(fā)生及其機(jī)制建立了一個(gè)良好的模型,且有望為臨床治療提供新的種子細(xì)胞。

      1 材料和方法

      1.1 材料

      人ES細(xì)胞株 (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室),knock-out DMEM(Gibco公司,美國),KO Serum Replacer(Hyclone 公司,美國),Non-essential Amino Acids(Gibco 公司,美國),L-glutamine(Sigma 公司,美國),β-mercaptoethanol(Sigma 公司,美國),b-FGF(Sigma 公司,美國),維甲酸 (Sigma公司, 美國),TGF-β1 (R&D 公司,美國),絲裂霉素 C(Sigma 公司,美國),Oct-4 抗體(兔抗小鼠多抗,中科院上海生化細(xì)胞所),SSEA-4抗體(兔抗小鼠多抗,中科院上海生化細(xì)胞所),兔抗人Ⅷ因子抗體 (Santcruz公司,美國),鼠抗CD34單抗(Santcruz公司,美國),昆明小鼠(山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)。

      1.2 方法

      1.2.1 人 ES 細(xì)胞培養(yǎng)

      培養(yǎng)液為knock-out DMEM,含20%knock-out serum replacer、1%non-essential amino acids、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanol、4 ng/mL bFGF。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);5~7 d后,以 1 mg/mL Ⅳ型膠原酶消化,常規(guī)傳代。

      1.2.2 擬胚體培養(yǎng)及誘導(dǎo)

      取生長良好的人ES細(xì)胞,機(jī)械法分割成小塊,接種到預(yù)先鋪陳1%瓊脂的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)液為knock-out DMEM,含 20%knock-out serum replacer、1%non-essential amino acids、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanol,加維甲酸,至終濃度為1×10-9mol/L ,37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 3~5 d,收集生長較好的擬胚體,均等地移植到預(yù)先用0.1%明膠鋪陳的培養(yǎng)皿中,每孔約3~4個(gè)擬胚體,加含3 ng/mL TGF-β1的無血清DMEM,每隔2天換液,繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)照組加不含TGF-β1的無血清DMEM。每天觀察照相,并做相關(guān)檢測(cè)。

      1.2.3 免疫熒光檢測(cè)

      抗體:兔抗人Ⅷ因子抗體,工作濃度1∶100;羊抗兔IgG-羅丹明,工作濃度1∶50。免疫熒光染色:待擬胚體周圍分化出上皮樣和圓形細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)時(shí),用PBS漂洗3遍,4%多聚甲醛固定10 min,再次PBS漂洗,0.25%Triton處理10 min,滴加Ⅷ因子抗體,37℃溫育1 h,PBS洗 3次,加 IgG-羅丹明,37 ℃反應(yīng) 45 min,PBS 漂洗,甘油/PBS(1∶2)封固,熒光顯微鏡觀察,照相。

      1.2.4 Dil-Ac-LDL 標(biāo)記檢測(cè)

      以無血清DMEM稀釋Dil-Ac-LDL為10 μg/mL,加至已分化出血管樣結(jié)構(gòu)的擬胚體培養(yǎng)皿中,37℃孵育4 h,將其去除,無血清DMEM洗3遍,熒光顯微鏡觀察,照相。

      1.2.5 掃描電鏡觀察

      取誘導(dǎo)后分化出的上皮樣和圓形細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu),以2%戊二醛固定,PBS漂洗,1%鋨酸固定,PBS漂洗,梯度乙醇脫水,醋酸正戊酯置換,CO2臨界點(diǎn)干燥,離子噴射儀噴金,掃描電鏡觀察。

      1.2.6 透射電鏡觀察

      取誘導(dǎo)后分化出的上皮樣和圓形細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu),2%戊二醛固定24 h,收集標(biāo)本,1%鋨酸后固定1 h,梯度乙醇脫水,1∶1丙酮包埋液滲透,EPON包埋,常規(guī)超薄切片,透射電鏡(JEM-1200EX)觀察細(xì)胞與血管的超微結(jié)構(gòu)。

      2 結(jié)果

      2.1 人ES細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)

      體外培養(yǎng)的人ES細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上以巢狀方式生長(圖1),細(xì)胞間界限清楚,細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單,細(xì)胞核質(zhì)比例高。

      圖1 人ES細(xì)胞克?。≒17)(相差顯微鏡,100×)

      2.2 擬胚體培養(yǎng)及誘導(dǎo)

      培養(yǎng)的第5天,培養(yǎng)皿中形成球形的擬胚體,透亮、邊緣光潔 (圖2)。將EB貼壁,用含3 ng/mL TGF-β1的無血清DMEM誘導(dǎo),第2天,EB周圍出現(xiàn)上皮樣和圓形細(xì)胞(圖3);第3天,開始出現(xiàn)由圓形細(xì)胞構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu),且圓形細(xì)胞逐漸變?yōu)楸馄綘罴?xì)胞。管狀結(jié)構(gòu)自EB向周圍呈輻射狀生長,并漸連接成網(wǎng)狀,管道排列清楚(圖4)。誘導(dǎo)組約有95%可分化為這類結(jié)構(gòu),而對(duì)照組絕大多數(shù)EB周圍未發(fā)現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。

      圖2 人ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(相差顯微鏡,100×)

      圖3 擬胚體貼壁第2天,圓形細(xì)胞出現(xiàn)(相差顯微鏡,100×)

      圖4 擬胚體貼壁第3天,上皮樣細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(相差顯微鏡,100×)

      2.3 免疫熒光檢測(cè)

      人ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞,經(jīng)Ⅷ因子免疫熒光檢測(cè)呈陽性(圖5),證明這類細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。

      圖5 人ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的管狀結(jié)構(gòu)Ⅷ因子表達(dá)陽性(40×)

      2.4 Dil-Ac-LDL 標(biāo)記檢測(cè)

      Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性,表現(xiàn)為紅色熒光(圖6),證明hES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

      圖6 Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)陽性

      2.5 掃描電鏡觀察

      管狀結(jié)構(gòu)的管壁最初由許多圓形細(xì)胞和扁平狀細(xì)胞組成,隨著管狀結(jié)構(gòu)的延伸,細(xì)胞逐漸減少,管壁變得光滑(圖7)。

      圖7 掃描電鏡觀察

      2.6 透射電鏡觀察

      誘導(dǎo)出的血管樣結(jié)構(gòu)由幾個(gè)內(nèi)皮樣細(xì)胞圍成,細(xì)胞扁平,表面較光滑,相鄰的細(xì)胞間連接緊密,與正常毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)非常相似(圖8)。

      圖8 透射電鏡觀察

      3 討論

      血管形成是非常復(fù)雜的過程,主要涉及內(nèi)皮細(xì)胞的激活和增殖、微環(huán)境中的細(xì)胞基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu),以及它們之間的相互作用[8]。同時(shí),這些過程又和各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生及協(xié)同作用是分不開的[9-10]。已有證據(jù)表明,TGF-β1是血管形成的刺激因子,在創(chuàng)傷愈合過程中,可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)合成,從而影響內(nèi)皮細(xì)胞的生長行為,使其形成管狀結(jié)構(gòu)[11-12]。另有研究認(rèn)為,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖刺激或抑制效應(yīng)依賴于 TGF-β1的濃度,0.02~0.1 ng/mL 的 TGF-β1 對(duì)胎牛心臟內(nèi)皮細(xì)胞顯示生長刺激作用,而高濃度(0.5~10 ng/mL)的 TGF-β1 則顯示生長抑制作用[13],表明TGF-β1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管結(jié)構(gòu)形成有著密切關(guān)系。

      ES細(xì)胞不同的生長方式和所受RA濃度對(duì)其分化細(xì)胞類型有重大影響[14]。低濃度RA(1×10-9mol/L)和TGF-β1協(xié)同作用,易使ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成中胚層性質(zhì)的分化細(xì)胞[15]。本實(shí)驗(yàn)用懸浮培養(yǎng)法結(jié)合低濃度RA處理5 d,使人ES細(xì)胞形成EB,然后移至明膠包被的培養(yǎng)皿中,以含TGF-β1的培養(yǎng)液使其貼壁生長,數(shù)天后EB周圍出現(xiàn)大量圓形細(xì)胞,同時(shí)形成許多自EB向周圍輻射的血管樣結(jié)構(gòu),該現(xiàn)象重復(fù)性高,表明低濃度RA和TGF-β1協(xié)同作用,對(duì)人ES分化并形成管樣結(jié)構(gòu)有重要作用。

      vWF是一種存在于血漿中的大分子糖蛋白,是凝血因子Ⅷ的載體,主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成,可使血小板黏附并聚集在受損的血管壁。vWF被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記[16]。DiI是一種親脂性碳花青染料,容易嵌進(jìn)生物質(zhì)膜內(nèi),并在膜內(nèi)做定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng),從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞。熒光染料DiI標(biāo)記的低密度脂蛋白 (Low density lipoprotein,LDL), 即 Dil-LDL被廣泛應(yīng)用于內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定[2,17-18]。本實(shí)驗(yàn)中,vWF免疫熒光染色和Dil-LDL直接熒光檢測(cè)結(jié)果均為陽性,表明構(gòu)成管樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。證明低濃度RA和TGF-β1可誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞及血管樣結(jié)構(gòu)。

      相差顯微鏡和掃描電鏡觀察證實(shí),人ES細(xì)胞所分化的管狀結(jié)構(gòu)的管壁,最初由許多圓形細(xì)胞或扁平狀細(xì)胞組成,隨著管狀結(jié)構(gòu)的延伸,管壁變得光滑。該結(jié)果提示,本誘導(dǎo)體系作用于人ES細(xì)胞,可在體外模擬血管形成的演變過程。

      透射電鏡結(jié)果顯示,誘導(dǎo)的血管樣結(jié)構(gòu)由扁平細(xì)胞圍成,細(xì)胞表面較光滑,相鄰細(xì)胞間有緊密連接,與正常的人毛細(xì)血管非常相似。

      本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)研究內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生和血管形成的模型。但是,RA與TGF-β1的作用機(jī)制,以及ES細(xì)胞向血管演變中參與的因素等問題尚需進(jìn)一步研究。另外,作為內(nèi)皮細(xì)胞的來源之一,ES細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的研究還面臨很多問題,如分化細(xì)胞的純化,傳代與大量擴(kuò)增以及保存等,這些問題的解決,將能使ES細(xì)胞成為較好的種子細(xì)胞來源。

      [1]Noden DM,Li X.The development of craniofacial blood vessels.//Reinber RN,Sherar GK,Auerbach R.Development of the vascular system[M].Basel:Karger,1991,1-24.

      [2]Levenberg S,Golub JS,Amit M,et al.Endothelial cells derived from human embryonic stem cells[J].PNAS,2002,99(7):4391-4396.

      [3]Levenberg S,Huang NF,Lavik E,et al.Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds[J].PNAS,2003,100(22):12741-12746.

      [4]Ferreira LS,Gerecht S,Fuller J,et al.Bioactive hydrogel scaffolds for controllable vascular differentiation of human embryonic stem cells[J].Biomaterials,2007,28(17):2706-2717.

      [5]Krtolica A,Genbacev O,Escobedo C,et al.Disruption of apicalbasal polarity of human embryonic stem cells enhances hematoendothelial differentiation[J].Stem Cells,2007,25(9):2215-2223.

      [6]Sepúlveda P,Martinez-León J,García-Verdugo JM,et al.Neoangiogenesis with endothelial precursors for the treatment of ischemia[J].Transplant Proc,2007,39(7):2089-2094.

      [7]Adams B,Xiao Q,Xu Q.Stem cell therapy for vascular disease[J].Trends Cardiovasc Med,2007,17(7):246-251.

      [8]Gajdusek CM,Luo Z,Mayberg MR.Basic fibrobl growth factor and transforming growth factor beta-1:synergistic mediators of angiogenesis in vitro[J].Cell Physiol,1993,157:133-149.

      [9]Lagarkova MA,Volchkov PY,Philonenko ES.Efficient differentiation of hESCs into endothelial cells in vitro is secured by epigenetic changes[J].Cell Cycle,2008,7(18):2929-2935.

      [10]Goumans MJ,van Zonneveld AJ,ten Dijke P.Transforming growth factor beta-induced endothelial-to-mesenchymal transition:a switch to cardiac fibrosis[J].Trends Cardiovasc Med,2008,18(8):293-298.

      [11]Madri JA,Pratt BM,Tucker AM.Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-β depends upon the composition and organization of extracellular matrix[J].Cell Biol,1988,106:1375-1384.

      [12]Roberts AB,Sporn MB,Assoian RK,et al.Transforming growth factor type β:Rapid induction of fibrosis and angiogenesis in vivo and stimulation of collagen formation in vitro[J].PNAS,1986,83:4167-4171.

      [13]Myoken Y,Kan M,Sato GH,et al.Biofunctional effects of TGF-β on endothelial cell growth correlates with phenotypes of TGF-β binding sites[J].Exp Cell Res,1990,191:299-304.

      [14]徐潔,叢笑倩,姚鑫.維生素A酸和雙丁酰基環(huán)腺苷單磷酸對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),1991,24:355-367.

      [15]Mummery CL,Slager HG,Inzen WV,et al.Regulation of growth and differentiation in early development:of mice and models[J].Reproductive Toxicity,1993,7:145-154.

      [16]Hoyer LW.The factorⅧcomplex:Structure and function[J].Blood,1981,58:1-13.

      [17]Takayuki Asahara,Toyoaki Murohara,Alison Sullivan,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Sci,1997,275(14):964-967.

      [18]Wang R,Clark R,Bautch VL.Embryonic stem cell-derived cystic embryoid bodies form vascular channels:an in vitro model of blood vessel development[J].Development,1992,114:303-316.

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