戴婷婷 蔣朝華 周廣東 劉偉 李圣利

組織工程技術(shù)構(gòu)建淋巴管的關(guān)鍵是要形成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（Lymphatic endothelial cells，LEC）與生物支架的三維復(fù)合體。目前，組織工程研究中，應(yīng)用較多的可降解人工合成材料是聚羥基乙酸（Polyglycolic acids，PGA）。該材料可加工成直徑 15 μm 的纖維，具有以下特點(diǎn)：能形成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)；具有較好的生物相容性；通過調(diào)整分子量大小，可以控制降解速度；其體內(nèi)最終降解產(chǎn)物為CO2和水，對(duì)機(jī)體無毒副作用。作為一種生物相容性良好的人工合成生物材料，PGA已在軟骨、骨和肌腱等組織工程的臨床研究中顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力[1-3]。

本實(shí)驗(yàn)選用PGA作為人LEC黏附生長的支架，研究LEC與PGA的生物相容性，探討PGA支架應(yīng)用于組織工程化淋巴管構(gòu)建的可能性

1 材料和方法

1.1 生物支架PGA的制備

取直徑為15 μm，重量為60 mg的PGA纖維（ALBANY公司），制成20 mm×15 mm×1 mm的薄片，75%乙醇浸泡1 h后，PBS反復(fù)沖洗3次，吸干水分后，紫外燈照射30 min消毒備用。

1.2 LEC的分離、培養(yǎng)

取幼兒包皮環(huán)切術(shù)后廢棄的包皮，2塊為一組，反復(fù)清洗，去除皮下疏松結(jié)締組織，采用中性蛋白酶（Roche 公司）結(jié)合膠原酶（Gibco 公司）消化，CD34陰性分選和CD31陽性磁珠（Dynal公司）分選，獲得CD34－/CD31＋細(xì)胞[4-6]。用完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（EGM-2-MV）（Lonza公司）重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105cells/mL后，接種于用20 ng/mL纖維連接蛋白（Sigma公司）鋪底的6孔板中培養(yǎng)。3～4 d換液1次。細(xì)胞生長到90%融合后，以0.05%胰蛋白酶消化，1∶3～4傳代于6孔板中 （無需纖維連接蛋白鋪盤）。用于制作細(xì)胞爬片的玻片也需預(yù)先用20 ng/mL纖維連接蛋白處理。

1.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定[7-9]

CD34－/CD31＋細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，分別滴加鼠抗人Podoplanin抗體（1∶100）和 VEGFR-3 抗體（1∶100），37 ℃孵育30 min；PBS漂洗3次，滴加FITC熒光二抗，37℃孵育30 min；PBS漂洗3次，蒸餾水漂洗3次，熒光顯微鏡觀察。

1.4 細(xì)胞與PGA支架復(fù)合物的體外培養(yǎng)

消化、離心第4代LEC，將細(xì)胞濃度濃度至1×107cells/mL，制成細(xì)胞懸液，接種到PGA支架上，置 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4 h后加 10 mL EGM-2培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d，每隔2天換液一次。

1.5 掃描電鏡觀察

取培養(yǎng)1周的LEC-PGA復(fù)合物，PBS洗滌，2.5%戊二醛固定，系列脫水，乙腈置換，真空干燥，表面噴金后行掃描電鏡觀察并攝像。

1.6 RT-PCR檢測(cè)

取培養(yǎng)1周的LEC-PGA復(fù)合物，TRIzol法行RNA 抽提。 RT：20 μL 反應(yīng)體系，25 mmol/L MgCl24 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，40 U/L RNase抑制劑 0.5 μL，5 U/L AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，200 ng／I～LOligo dT-Adaptor Primer 1 μL，RNA 2 μg，加無 RNase 水至 20 μL；反應(yīng)條件為 30℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。PCR：引物序列包括人Prox上游引物5-CTCATAAAGTCCGAGTGCG-3， 下 游 引 物 5－AACATCTTTGCCTGCGATA-3；人Podoplanin上游引物5-GTGTAACAGGCATTCGCATCG-3，下游引物5-GGCAAGTGTTCCACGGGTC-3；人LYVE-1上游引物5-GTTTCTTTCATGCTCCTTACCC-3，下游引物5－GTCTCAGTGACTCCTTGGCTTT-3； 人 VEGFR-3上游引物5-AGAGGAACCAGGAGGACAAG-3，下游引物 5-CAGGTGCTGAAGGGACATT-3。 20 μL 反應(yīng)體系：ddH2O 13.8 μL，25 mmol／L MgC121.6 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 μL，10 mmol／L dNTP 0.5 μL，5 U/L Taq 酶 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，20 pmo～L 目的基因上下游引物各0.3 μL。反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s， 共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳圖像分析：PCR產(chǎn)物 20 μL經(jīng)1.2%瓊脂糖、70 V電壓電泳1.5 h后，進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 LEC的鑒定

酶消化結(jié)合免疫磁珠分選法獲取的LEC，純度高，呈內(nèi)皮細(xì)胞典型的鋪路石樣排列（圖1）；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示，CD34－/CD31＋細(xì)胞呈現(xiàn)LEC特異性標(biāo)志Podoplanin和VEGFR-3（圖2）。

圖1 單層培養(yǎng)的LEC呈典型的鋪路石樣排列（40×）

圖2 細(xì)胞免疫熒光染色

2.2 LEC-PGA復(fù)合物掃描電鏡觀察

復(fù)合物體外培養(yǎng)3 d時(shí)，可見單個(gè)LEC呈類圓形，較扁平，細(xì)胞在與PGA接觸部位伸出細(xì)小偽足，黏附于PGA纖維；體外培養(yǎng)1周后，可見細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（圖3）。

圖3 LEC-PGA掃描電鏡觀察

2.3 RT-PCR

瓊脂糖凝膠電泳顯示，構(gòu)建產(chǎn)物能特異性表達(dá)LYVE-1 mRNA、Podoplanin mRNA、Prox-1 mRNA和 VEGFR-3 mRNA（圖 4）。

圖4 RT-PCR檢測(cè)LEC特異性表型

3 討論

淋巴系統(tǒng)阻塞性疾病的治療，迄今仍然是臨床的難題[10]。通過顯微淋巴外科技術(shù)吻合淋巴管，實(shí)現(xiàn)淋巴回流的重建，是目前治療阻塞性淋巴水腫的有效手段。但淋巴管移植材料缺乏，自身淋巴管移植后易引起供區(qū)水腫。組織工程技術(shù)的發(fā)展為上述難題的解決提供了新的思路[11-12]。

淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞層是執(zhí)行淋巴管生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，獲取足夠量的健康、有活力的種子細(xì)胞是構(gòu)建淋巴管內(nèi)皮層的首要問題。我們從幼兒包皮組織中獲取大量的LEC[5-6]，同時(shí)還證實(shí)了凍存的內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后無明顯形態(tài)學(xué)改變，并保持了較高的活力及體外增殖能力[13]。此方法獲得的LEC經(jīng)過鑒定，不僅純度高，而且表型可以維持10代以上。我們采用第4代細(xì)胞接種材料，細(xì)胞狀態(tài)成熟穩(wěn)定，增值能力強(qiáng)，接種時(shí)將其調(diào)整到合適的細(xì)胞濃度（5×107cells/mL），使其達(dá)到與PGA支架復(fù)合的最佳條件。PGA纖維為細(xì)胞生長、遷移、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌提供了條件，同時(shí)伴隨著自身的降解，引導(dǎo)新生的組織按照支架模型的三維結(jié)構(gòu)生長。PGA是典型的合成可降解聚合物，降解后生成羥基乙酸。由于羥基乙酸是體內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間代謝物，且吸收和代謝機(jī)理已經(jīng)明確，并具有可靠的生物安全性，已被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床，廣泛用于組織工程化軟骨、骨、肌腱和皮膚等的研究。Niklason等[14]以PGA為支架材料，成功構(gòu)建了組織工程化血管。

本實(shí)驗(yàn)首次選用PGA作為支架材料，進(jìn)行LEC-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)研究。結(jié)果表明：淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞可在PGA形成的三維空間結(jié)構(gòu)中生長并分泌基質(zhì)，維持其表型不變；PGA對(duì)細(xì)胞生長無明顯不良影響。綜上所述，可以認(rèn)為PGA是構(gòu)建組織工程化淋巴管內(nèi)皮層的合適材料。我們將在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展構(gòu)建含平滑肌層與內(nèi)皮層的組織工程化淋巴管的研究。

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