劉立新,張羽男,張楠楠,袁 寰

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

近年來,雄性動物生殖機(jī)能減退現(xiàn)象逐漸受到人們的重視,出現(xiàn)了諸如性欲減退、精液品質(zhì)下降、受精能力降低的現(xiàn)象,人類更是受到了“ED(勃起功能障礙)”的困擾。當(dāng)然,生殖功能下降是由多方面原因引起的,但藥物是其主要因素之一。雷公藤多苷是從植物雷公藤根提取精制而成的一種脂溶性成分混合物,是目前臨床上使用較多的中成藥制劑,其臨床應(yīng)用范圍廣泛,幾乎涉及內(nèi)科、外科、皮膚科、眼科、兒科等廣泛生命科學(xué)領(lǐng)域。但隨著雷公藤多苷應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,其毒副作用也越來越受到人們關(guān)注,尤其在生殖毒性方面。動物實(shí)驗(yàn)表明,雷公藤多苷可使雄性大鼠產(chǎn)生可逆性不育,有關(guān)雷公藤多苷生殖損害方面的報(bào)道多見集中在體內(nèi)的研究,且僅限于成年鼠,而對于體外和有關(guān)幼鼠的研究鮮有報(bào)道,本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的幼鼠睪丸生精細(xì)胞為研究對象,從細(xì)胞水平探討雷公藤多苷對幼鼠生殖細(xì)胞的毒性,為進(jìn)一步揭示雷公藤多苷生殖毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

動物:15d齡 SD雄性大鼠,購自哈藥集團(tuán)制藥總廠實(shí)驗(yàn)動物中心。藥品:雷公藤多苷片(江蘇美通制藥有限公司);四噻唑藍(lán)(M TT)(Amresco產(chǎn)品);其他化學(xué)試劑均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(HPP-9162北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);970CRT熒光分光光度計(jì)(上海棱光精密科學(xué)儀器有限公司);318型酶標(biāo)監(jiān)測儀(上海科學(xué)儀器三廠)。

1.3 方法

1.3.1 幼鼠睪丸生精細(xì)胞懸液的制備

參照文獻(xiàn)方法[1]略有改進(jìn),取15d雄性幼鼠,頸椎脫臼法處死。無菌收集兩側(cè)睪丸用無菌 PBS(0.01M,pH7.3)洗滌,去包膜,將生精小管剪為約3～ 4mm小段,加入0.01M PBS 2mL,吹打成懸液,300目篩網(wǎng)過濾,1000r/min,離心 5min,棄上清液;沉淀物加入 2mL0.01M PBS清洗,吹打均勻后,以1000r/min,離心 5min,棄上清液;如此重復(fù)清洗 2次;用 2mL 70%冰乙醇將細(xì)胞沉淀吹打、制成懸液,備用。

1.3.2 MTT比色法

將分離的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞長滿單層后,棄去培養(yǎng)液,加入含雷公藤多苷的培養(yǎng)液,使雷公藤多苷的終 濃度 分 別為 2.5μ g/L、 5μ g/L、 10 μg/L、20 μg/L、 40μ g/L同時設(shè)立不加雷公藤多苷的對照組和無細(xì)胞對照組,培養(yǎng)24h后,每孔加入 M TT溶液使其終濃度為0.5mg/mL。37℃恒溫孵育4h,吸去上清,每孔加入200 μL酸化異丙醇,震蕩 10min,使結(jié)晶物充分溶解,取100 μL溶液并轉(zhuǎn)移到一個新的96孔培養(yǎng)板,用酶標(biāo)儀在570nm波長測定吸光值,記錄結(jié)果,計(jì)算細(xì)胞的存活率,并計(jì)算 IC50。

1.3.3 幼鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的檢測

1.3.3.1 吖啶橙熒光染色法[2]

細(xì)胞培養(yǎng)長成單層后,加入含雷公藤多苷的培養(yǎng)液,使雷 公 藤 多 苷 的 終 濃 度 分 別 為 2.5μ g/L、 5μ g/L、 10μg/L、20 μg/L,同時設(shè)對照組,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,按1.3.3方法收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 1× 106/mL,取95μL細(xì)胞懸液加入5μL吖啶橙熒光染色液(100 μg/mL,pH6.0),混勻后,將細(xì)胞懸液滴加到載玻片上,于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),每個樣品計(jì)數(shù)100個細(xì)胞,根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)和細(xì)胞壞死指數(shù)。

凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)÷(正常活細(xì)胞數(shù)+凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù))×100%

1.3.3.2 TUNEL法

按試劑盒使用說明進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS及 Excel軟件進(jìn)行分析,所有值均以± s表示。

2 結(jié)果

2.1 M TT法檢測細(xì)胞活性

采用 MTT法對不同濃度雷公藤多苷作用的幼鼠生精細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性檢測,結(jié)果見表1和圖1。由表1和圖1可見,隨著雷公藤多苷濃度的增加,細(xì)胞的相對存活率下降,而且濃度越大細(xì)胞的存活率越低,具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,這表明雷公藤多苷對幼鼠生精細(xì)胞具有一定的毒性作用,能抑制細(xì)胞的活性,其 IC50為23.32±3.26。

表1 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細(xì)胞活率影響的結(jié)果±s)

表1 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細(xì)胞活率影響的結(jié)果±s)

圖1 MTT法測定雷公藤多苷對幼鼠生精細(xì)胞相對存活率的影響

2.2 雷公藤多苷致幼鼠生精細(xì)胞凋亡檢測

吖啶橙染色法:不同濃度雷公藤多苷作用的幼鼠生精細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后,顯微鏡下觀察,正常細(xì)胞核呈黃綠色均勻熒光。凋亡細(xì)胞呈黃綠色濃集在核膜內(nèi)側(cè),可見凋亡小體。由表2和圖2可以看出,隨著雷公藤多苷濃度的增加,凋亡指數(shù)逐漸增大,加雷公藤多苷藥物組與對照組比較差異均極顯著(P＜0.01)。

表2 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細(xì)胞吖啶橙熒光染色的結(jié)果 ±s)

表2 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細(xì)胞吖啶橙熒光染色的結(jié)果 ±s)

圖2 雷公藤多苷對幼鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

TUN EL法:雷公藤多苷作用的細(xì)胞經(jīng)染色后,顯微鏡下觀察,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核中有棕色顆粒,非凋亡細(xì)胞用蘇木素復(fù)染為藍(lán)紫色核。隨著雷公藤多苷濃度的增加,幼鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸增加,加雷公藤多苷藥物組與對照組間比較差異均極顯著 (P＜0.01),見表2和圖2。

3 討論

雷公藤多苷是雷公藤根芯的提取物[3],具有廣泛的藥理作用,從治療風(fēng)濕性疾病到系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、腎小球疾病、腫瘤,到應(yīng)用于甲狀腺疾病、婦科疾病、哮喘等疾病,新近臨床上又應(yīng)用于器官移植如腎移植取得了重大進(jìn)展[4],但長期大量應(yīng)用會對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用,而導(dǎo)致不孕。盧清顯等[5]給大鼠每日喂服雷公藤總苷10mg/kg17周、13周和20mg/kg14周、10周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠精子發(fā)生及曲細(xì)精管晚期精子細(xì)胞堿性核蛋白的替代和轉(zhuǎn)換均受到明顯抑制。張彬[6]等給 Wistar雄性大鼠每日灌服雷公藤多苷(10mg/kg)8周后,睪丸內(nèi)的精子細(xì)胞及精子減少,曲細(xì)精管管腔緣出現(xiàn)病理形態(tài)的細(xì)胞及多核巨細(xì)胞。本試驗(yàn)應(yīng)用 MTT比色法測定了雷公藤多苷對幼鼠睪丸生精細(xì)胞活率的影響,又通過吖啶橙染色法和 TUNEL法測定了雷公藤多苷對幼鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡情況的影響,結(jié)果表明,隨著雷公藤多苷濃度的增加,細(xì)胞活性逐漸降低,細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸升高,并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,揭示了雷公藤多苷對幼鼠睪丸生精細(xì)胞具有明顯的毒性作用。

[1] 楊瑞.剛地弓形蟲致小鼠肇丸生精細(xì)胞損傷機(jī)制的探討 [D].山西醫(yī)科大學(xué),2007,9

[2] 王心如.毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù) [M].第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007,141

[3] 周嘉陵,朱琦,楊曉凌,等.雷公藤制劑副作用的臨床觀察 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1999,19(2):77-79

[4] 黃真,毛慶秋.雷公藤多苷的臨床應(yīng)用、不良反應(yīng)及預(yù)防[J].藥品評價,2005,2(2):125

[5] 盧清顯,沈曉明,程凱,等.雷公藤總甙對大鼠生精作用及主要臟器的影響 [J].國科學(xué)院學(xué)報(bào),1990,12(3):203-206

[6] 張彬.雷公藤多苷(GTW)抗雄性生育活動的研究 [J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2002,12(4):16-17