散發(fā)性大腸癌中 hMLH1、hM SH2和 Rb的表達(dá)及意義△

西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科(西安 710077)鄭建云 趙喜鳳 劉 冰 任天順

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段、逐步演進(jìn)的過(guò)程。錯(cuò)配修復(fù)基因(Mismatch repair gene,MM R)缺失是大腸癌發(fā)生的重要因素之一,并且有研究表明在散發(fā)性腫瘤中 MM R基因失活是由單個(gè)人類(lèi) mut-s同系物 1(Human mut-lhomologue 1,hM LH1)基因引起,它會(huì)引起基因更高突變率,從而使發(fā)生在某些原癌基因和抑癌基因中的突變得到快速積累,并最終影響到正常細(xì)胞的增殖調(diào)控,誘發(fā)癌變[1]。本研究采用免疫組化法檢測(cè) 63例大腸癌組織、癌旁及正常組織中 MM R基因 hML H1、人類(lèi) mut-s同系物 2(Human mut-s homologue 2,hMSH2)和抑癌基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因蛋白(Retinoblastoma gene protein,Rb)的表達(dá),旨在探討它們?cè)诖竽c癌形成過(guò)程中的變化規(guī)律及其與臨床病理特征的相互關(guān)系。

資料與方法

1 臨床資料 收集我院 2007年 1月至 2008年1月 63例手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本。其中男 42例,女 21例;年齡 30～ 80歲 ,平均 62.59歲;結(jié)腸癌 33例,直腸癌 30例;高分化腺癌 12例,中分化腺癌 39例,低分化腺癌 12例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 18例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 45例;浸潤(rùn)范圍:漿膜層 39例,肌層及黏膜下層 24例。同時(shí)取距癌灶 3 cm以外的癌旁組織、10 cm以外的正常組織。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療和化療。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,厚度4 μ m,HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

2 HE染色 常規(guī) HE染色,光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,以確定病理診斷及分級(jí)。

3 實(shí)驗(yàn)試劑 一抗均為即用型,hMLH1(克隆系:14)/hMSH2(克隆系:FE11)鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司,Rb(克隆系:1F8)鼠抗人單克隆抗體和即用型 Max-Vision檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

4 免疫組化方法 采用 Max Vision二步法,抗原修復(fù)用 EDTA(pH 8.0)高壓鍋熱修復(fù)法,每批染色均設(shè)立已知陽(yáng)性對(duì)照及用 PBS代替一抗的陰性對(duì)照,免疫組化染色具體步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

5 結(jié)果判定 hMLH1、hMSH2和 Rb陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞核,以細(xì)胞中相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。參照 Fromowitz方法[2],在高倍鏡下對(duì)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)作如下評(píng)分:無(wú)著色為 0分,淡黃色為 1分,棕黃色為 2分,棕褐色為 3分,陽(yáng)性范圍:＜5%為 0分,5%～ 25%為 1分,26%～ 50%為 2分,51%～75%為3分,＞75%為 4分。兩項(xiàng)結(jié)果相加 ＜2分為陰性,2～ 7分為陽(yáng)性。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,兩兩間比較采用χ2檢驗(yàn)。 hMLH1、hMSH2和 Rb在大腸癌中的表達(dá)相互間關(guān)系用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)中 Spearman等級(jí)相關(guān)分析,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 hM LH1在大腸正常組織、癌旁組織及大腸癌組織中的表達(dá) 見(jiàn)表 1。

2 hM LH1、hMSH2、 Rb的表達(dá)與大腸癌臨床病理之間的關(guān)系 見(jiàn)表 2。

表1 hMLH1、hMSH2和 Rb在大腸正常組織、癌旁組織及大腸癌組織中的表達(dá)

hM LH1在大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)(81%)低于癌旁(85.7%)和正常組織(95.2%),兩者與正常組有顯著性差異(P＜0.05);hMSH2在大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)(52.4%)低于癌旁(66.7%)和正常組織(76.2%),兩者與正常組有極顯著性差異(P＜0.01);Rb在大腸癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率(100%)高于癌旁(95.2%)和正常組織(47.6%),兩者與正常組有極顯著性差異(P＜0.01),并在中、低分化大腸癌組中陽(yáng)性表達(dá)(100%)高于高分化大腸癌組(75%),兩組有極顯著性差異(P＜0.01)。

hM LH1在小于 60歲大腸癌組中陽(yáng)性表達(dá)(100%)高于大于等于 60歲大腸癌組(75%),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大腸癌組中陽(yáng)性表達(dá)(50%)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大腸癌組(93.3%),兩組有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01),在不同性別,不同部位,不同分化程度及癌組織不同浸潤(rùn)范圍大腸癌組織中表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05);hM SH2在小于 60歲大腸癌組中陽(yáng)性表達(dá)(80%)高于大于等于 60歲大腸癌組(43.8%),在癌組織浸潤(rùn)腸壁漿膜層大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)(61.5%)高于浸潤(rùn)肌層大腸癌組(37.5%),兩組有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05),hM SH2在不同性別,不同部位,不同分化程度及有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大腸癌組織中表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞ 0.05);Rb在不同性別,不同年齡,不同部位,不同浸潤(rùn)范圍及有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大腸癌組織中表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表2 hMLH1、hMSH2和 Rb的表達(dá)與大腸癌臨床病理特點(diǎn)間的關(guān)系

討 論

大腸癌的病因除了與飲食、環(huán)境等因素有關(guān)外,研究表明 MM R基因突變和功能異常,是導(dǎo)致大腸癌發(fā)生的重要途徑,但目前認(rèn)為單獨(dú) MM R缺陷不足以引起腫瘤,MM R功能缺失導(dǎo)致一些抑癌基因突變率增加和突變的積累促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

近年研究表明,MM R功能缺失引起部分散發(fā)性大腸癌的發(fā)生和發(fā)展[3]。Lindor檢測(cè) 1114例散發(fā)性大腸癌 hMLH1和 hMSH2的表達(dá)[4],發(fā)現(xiàn) 228例出現(xiàn)hM LH1表達(dá)缺失,98例出現(xiàn) hMSH2的表達(dá)缺失。而Leach等與以上研究結(jié)論不同[5],在散發(fā)性大腸癌中hM SH2蛋白高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 hMSH2在大腸癌中的表達(dá)缺失率(47.62%)高于 hM LH1(19.05%),就基因表達(dá)缺失率而言,與上述研究結(jié)果有相符也有不相符的,但均提示在大腸癌中,hM LH1和 hMSH2存在一定缺失率。本研究還顯示,hMLH1和hMSH2表達(dá)缺失率從正常組織、癌旁組織到癌組織逐漸升高,提示癌旁組織已經(jīng)有 MMR的基因的突變或功能異常,MMR基因的突變,尤其是 hM LH1和 hM SH2的突變可能是大腸癌發(fā)生的早期事件之一。而且隨著年齡的增長(zhǎng),hMLH1和 hM SH2表達(dá)缺失率逐漸升高,尤其是≥60歲年齡組缺失率明顯高于 ＜60歲年齡組,兩組有顯著性差異。 Buermeyer等[6]在散發(fā)性大腸癌 hMLH1基因蛋白表達(dá)的免疫組化研究中發(fā)現(xiàn),hM LH1表達(dá)缺失無(wú)一在 40歲以下人群中出現(xiàn),而 90歲以上人群中29%出現(xiàn) hMLH1表達(dá)缺失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究大腸癌在高齡患者中常見(jiàn)的發(fā)病特點(diǎn)相吻合,在一定程度上也說(shuō)明了高齡所造成的 hM LH1和 hMSH2表達(dá)缺失與大腸癌的發(fā)生具有一定的關(guān)系。我們還發(fā)現(xiàn)hMLH1的陽(yáng)性表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例組顯著降低,hMSH2的陽(yáng)性表達(dá)在浸潤(rùn)范圍廣的病例中顯著升高,雖然其機(jī)制還有待探討,但可以推測(cè) hMLH1和hM SH2的表達(dá)水平高低在判斷大腸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面具有一定的意義。

另有研究表明單獨(dú) MMR基因缺陷不足以引起腫瘤[7],這種缺陷主要通過(guò)兩條途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,其中最主要的途徑是增加癌基因和抑癌基因的突變率,誘發(fā)癌變。 Rb是第一個(gè)被成功克隆的人抑癌基因。Rb基因的失活與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),但 Rb基因在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用所知甚少,Gope(1990)首次報(bào)道[8],在大腸癌中 Rb基因過(guò)度表達(dá),機(jī)制可能是 Rb基因發(fā)生了點(diǎn)突變,導(dǎo)致單個(gè)氨基酸的替代、置換,發(fā)生一種失活的 Rb蛋白,此蛋白不能對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮調(diào)控作用,引起細(xì)胞異常大量增殖,Rb基因的結(jié)構(gòu)改變與表達(dá)異常,可能是一些大腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示 Rb在大腸正常組織、癌旁組織和癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)逐漸升高,而且差異顯著,并且隨著分化程度的降低陽(yáng)性表達(dá)逐漸升高,與上述研究觀點(diǎn)符合,可以推測(cè) Rb陽(yáng)性表達(dá)在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。綜上所述,散發(fā)性大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程可能至少有兩條途徑,Rb過(guò)表達(dá)及 MM R基因缺失。采用免疫組化方法快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效,有利于臨床推廣?？傊瓾MLH1、hMSH2和 Rb可以作為臨床預(yù)測(cè)和判斷大腸癌發(fā)生、發(fā)展有用的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

[1]許銘炎,鄧小玲,徐小虎,等.DNA錯(cuò)配修復(fù)基因與腫瘤研究新進(jìn)展[J].癌變、畸變、突變,2002,14(4):114-116.

[2]Fromowitz FB,Viola MV,ChaoS,et al.Res p21 expression in the progression of breast cancer[J].Hum Pathol,1987,18(12):1268-1275.

[3]WangY,Friedl W,LambertiC,et alHereditary nonpolyposis colorectal cancer:frequent occurrence of large genomic deletions in M SH2and M LH1genes[J].Int J Cancer,2003,130(5):636-641.

[4]LindorNM, BurgartL J, Leontovich O,et al.Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing in phenotyping colorecatl tumors[J]. J Clin Oncol,2002,20(4):1043-1048.

[5]Leach FS,Hsieh JT,Molberg K,et al.Expression of the human mismatch repair gene hMSH2a potential marker for urothelial malignancy[J].Cancer,2000,88(10):2333-2341.

[6]Buermeyer AB,Deschenes SM,Baker SM,et al.Mammalian DN A misatch repair[J].Ann RevGenet,1999,33:533-564.

[7]范 凱 ,馬堅(jiān)妹,王朝暉,等.胃癌中 hM LH1,hMSH2,PTEN,和 PCN A表達(dá)的相關(guān)性及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2006,22(2):236-237.

[8]Gope R,Christensen M A,Thorson A,et al.Increased expression of the retinoblastoma gene in human colorectal carcinomas relative to normal colonic mucosa[J].J Natl Cancer Inst,1990,82(4):310-314.