楊柳 許曉芳 楊佰霞 柳雯 李頌

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科教研室；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科，安徽 合肥 230032）

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是已知的人類口腔主要致齲菌[1]，它所產(chǎn)生的細(xì)菌素叫變鏈素（mutacin）[2]，變鏈素對與其密切相關(guān)的菌種和其他革蘭陽性細(xì)菌具有抑制活性，變鏈素還具有最低抑菌濃度和抑制耐藥菌株的特性，這些生物學(xué)特性都可能使變鏈素成為某些耐藥抗生素的替換劑，逐漸走向治療用途[3]。

自1975年日本大阪大學(xué)牙科學(xué)院的Hamada等[2]把變異鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素樣抑菌物質(zhì)（bacteriocinlike inhibitory substances，BLIS）定義為變鏈素之后，不斷有新的變鏈素被發(fā)現(xiàn)。Caufield研究小組在1999至2001年間相繼分離純化變鏈素Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ[4-6]，Novák等[7]于1994年提取出變鏈素Ⅱ。其他研究者也已經(jīng)分離純化了幾種變鏈素，如變鏈素N、M46、M19、 H7[8-9]，變鏈素B-Ny266[3]，變鏈素1140[10]，2005年Hale等[11]從變異鏈球菌菌株UA159提純出變鏈素Ⅴ，2006年Nicolas等[12]發(fā)現(xiàn)H-29B與變鏈素Ⅱ類似，2007年Robson等[13]分離出變鏈素K8，目前這些變鏈素都已進(jìn)入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和基因分析階段。

但是由于變鏈素相對分子質(zhì)量小，天然產(chǎn)量低，直接從細(xì)菌體內(nèi)提取天然多肽物質(zhì)時，分離提純存在一定困難，而且步驟復(fù)雜，在一定程度上阻礙了國內(nèi)外學(xué)者們對新變鏈素的發(fā)現(xiàn)和研究。本實驗旨在探索和掌握變鏈素的分離純化方法，為進(jìn)一步從分子水平研究變鏈素奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

前期研究中得到的80株S.mutans臨床菌株，并經(jīng)過抑菌活性檢測，詳見參考文獻(xiàn)[14]，選擇出抑菌活性最強的菌株1G（抑菌環(huán)平均直徑為20mm）。指示菌株：口腔鏈球菌（Streptococcus oralis，S.oralis）ATCC 10557。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨-多價蛋白胨-酵母提取物（tryptone polypepton yeast-extract，TPY）液體培養(yǎng)基。孔徑0.22μm一次性濾器（Millipore公司，美國）。色譜分析柱tc-C18（Angilent tc-C18，4.6 mm×150 mm，Angilent公司，美國）。

1.3 主要儀器

Sep-PakR固相萃取柱（Waters公司，美國），厭氧培養(yǎng)箱（浙江義烏冷凍機總廠），超凈臺（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），冷凍干燥機（FTS公司，美國），高效液相色譜儀（Angilent公司，美國）。

1.4 變鏈素的粗提[2]

TPY培養(yǎng)基中的微量元素調(diào)整[5，12]為：每1 L水中七水硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.005 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.2 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1 g，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.7 g，硫酸錳（MnSO4）0.005 g，酵母提取物20 g，干酪乳清蛋白60 g，碳酸鈣（CaCO3）10 g。

復(fù)蘇已篩選的臨床株1G，接種于TPY固體培養(yǎng)基，厭氧條件下培養(yǎng)48 h，挑單菌落接種于10mL的調(diào)整配方后的TPY液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)16～24 h，再轉(zhuǎn)種于200mL的調(diào)整配方后的TPY液體培養(yǎng)基中繼續(xù)增菌48 h，將培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心20min，取上清液，再經(jīng)0.22μm孔徑的濾器過濾。將濾液與等量氯仿混合，4 000 r·min-1離心10min，收集水氯仿界面上的蛋白成份后，加等體積的雙蒸水混勻，8 000 r·min-1離心10min，棄上清，得到有抑菌活性的沉淀即為變鏈素的粗提物[15]。

1.5 變鏈素粗提物抑菌活性檢測[16]

將粗提物點樣于含指示株（S.oralis ATCC 10557）的TPY瓊脂平皿上，過夜厭氧培養(yǎng)，觀察抑菌環(huán)大小，相同條件重復(fù)實驗6次，取平均值，觀察其抑菌活性。

1.6 變鏈素粗提物的初步純化

1.6.1 樣品制備 將粗提物樣品（約15μg）與1mL雙蒸水充分混勻。

1.6.2 固相萃取柱的活化 先用1mL甲醇沖洗固相萃取柱中的填料，再用1mL雙蒸水沖洗，最后再用1mL的甲醇沖洗，上樣前勿讓填料中甲醇流干。

1.6.3 上樣 將制備的樣品加到柱床上，以1～5mL·min-1低流速通過填料。

1.6.4 沖洗 使用乙腈（5mL）洗脫吸附在固相萃取柱上的樣品至收集管中，每1mL收集1管，共5管，將收集液凍干后，再分別重溶于0.1%三氟乙酸（trifluoroactic acid，TFA）的100μL中，并從各管中取5μL檢測活性，最后將有抑菌活性的樣品管合并凍干，進(jìn)行下一步實驗[12]。

1.7 反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RT-HPLC）純化

將上述實驗得到的抑菌活性的樣品凍干重溶于體積分?jǐn)?shù)約0.1%的TFA100μL中。選用Angilent的色譜分析柱tc-C18柱，流動相選用AB緩沖液，A（0.1%TFA），B（100%乙腈），流速1.0mL·min-1，紫外線檢測波長220 nm，洗脫程序：A液平衡分析柱4min，再A、B緩沖液線性梯度洗脫30 min，進(jìn)樣量為100μL，柱溫為室溫。4min后開始收集洗脫液（每1管收集1mL，并記錄每管的時間和流動相B的體積分?jǐn)?shù)），凍干后測定所有洗脫液的抑菌活性，將有活性的物質(zhì)合并，凍干，再次重溶于100μL 0.1%的三氟乙酸中，以相同的洗脫條件進(jìn)行第2次RPHPLC純化，收集洗脫液并檢測活性，將有活性的部分收集并保存。

2 結(jié)果

2.1 變鏈素粗提結(jié)果

變異鏈球菌臨床分離株1G的變鏈素粗提物點樣后產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑平均值約為8mm（圖1）。

2.2 變鏈素粗提物的初步純化結(jié)果

粗提物經(jīng)固相萃取柱處理后的洗脫液檢測活性的結(jié)果見圖2。由圖2顯示，收集的共5管洗脫液均含有抑菌物質(zhì)，產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑均在5mm以上。另外0.1%的TFA的檢測活性結(jié)果顯示無抑菌環(huán)產(chǎn)生，提示0.1%TFA對菌株S.oralis ATCC 10557無抑制作用，對活性檢測結(jié)果無影響。

2.3 第1次RP-HPLC純化結(jié)果

收集的洗脫液第25～27管，對應(yīng)的洗脫時間為26.4 min到28.3 min之間（圖3的紅色加粗部分），經(jīng)檢測對S.oralis ATCC 10557有較明顯的抑菌活性（圖3A），流動相B的體積分?jǐn)?shù)為75.2%到81.3%。

2.4 第2次RP-HPLC分離純化結(jié)果

收集的洗脫液第26和27管，對應(yīng)的洗脫時間為25.8min到27.5 min（圖3的藍(lán)色加粗部分），經(jīng)檢測對S.oralis ATCC 10557有較明顯的抑菌活性（圖3 B），流動相B的體積分?jǐn)?shù)為73%到76.8%。2次RPHPLC純化的活性部分在色譜圖上的位置有重疊的部分，即75.2%～76.8%之間，且在同樣的位置有一明顯的峰出現(xiàn)即“peak 1”。

3 討論

變鏈素是變異鏈球菌產(chǎn)生的具有抗菌作用的多肽[2]，相對分子質(zhì)量小，天然產(chǎn)量低，分離純化步驟繁瑣，不易通過生物技術(shù)提取，而人工合成多肽的技術(shù)成本昂貴[17]。因此變鏈素的提取和純化困難成為眾多國內(nèi)外研究者們研究和發(fā)現(xiàn)新變鏈素的最大阻礙。

有學(xué)者[18-19]依據(jù)已知的變鏈素基因來尋找其氨基酸序列中具有活性的片段，并用來取代原多肽，該學(xué)者從變異鏈球菌菌株CH43中克隆出mutA基因片段，通過原核表達(dá)得到變鏈素Ⅰ的工程菌，為進(jìn)一步大量制備純化和研究其抑菌活性及抑菌作用機制奠定了基礎(chǔ)。但是對于尋找未知序列的新型變鏈素來說，顯然這種純化方法是無法完成的。因此必須要從變異鏈球菌臨床株的天然培養(yǎng)物中分離純化測序才能尋找到新的變鏈素。

關(guān)于變鏈素的分離純化，國內(nèi)外學(xué)者做過大量的研究。例如在培養(yǎng)基中增加微量元素[5]，增加酵母提取物的含量[3，12]，改變RP-HPLC的洗脫條件[6]，或增加反相高效色譜純化前的樣品預(yù)處理[12]，或反復(fù)RP-HPLC純化[5-6]來增加最后純化物的純度等。

Caufield的實驗室為了增加變鏈素的產(chǎn)量[5]，在TH培養(yǎng)基中加入一些微量元素，即每1 L水中加入FeSO4·7H2O（0.005 g）、K2HPO4（0.2 g）、KH2PO4（1 g）、MgSO4·7H2O（0.7 g）、MnSO4（0.005 g），該學(xué)者認(rèn)為加入這些微量元素可以維持液體培養(yǎng)基上清液中較高水平的變鏈素產(chǎn)量，而且還可以抑制其他肽類的生長。而Mota-Meira等[3]和Nicolas等[12]培養(yǎng)產(chǎn)生變鏈素B-Ny266和H-29B的菌株時所采用的TSB培養(yǎng)基均加入了干酪乳清蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%），碳酸鈣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），酵母提取物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%），研究者認(rèn)為以上3種物質(zhì)不僅價廉，而且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)是獲得變鏈素最佳產(chǎn)生量所需碳水化合物的最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

本實驗將所用的TPY培養(yǎng)基中的微量元素含量調(diào)整，再加入干酪乳清蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%），碳酸鈣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），酵母提取物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%），達(dá)到提高變鏈素產(chǎn)量的效果。

在變鏈素的初步分離純化的研究方法方面，即色譜純化前樣品處理方面，研究者們嘗試了各種方法。Novák等[7]在1994年從變異鏈球菌菌株T8的液體培養(yǎng)基中提取變鏈素Ⅱ，該學(xué)者將大量的培養(yǎng)液經(jīng)過相對分子質(zhì)量逐漸減小的濾膜進(jìn)行超濾（從1×105、1×104到1×103），再將最終的濾液與等量的氯仿混合萃取出粗提物，經(jīng)RP-HPLC和艾德曼降解法來進(jìn)行純化、氨基酸分析和測定。但是小相對分子質(zhì)量的濾膜造價昂貴且過濾時有一定的損失，因此沿用此方法的學(xué)者較少。

之后2001年Qi等[6]采用氯仿抽提法對變異鏈球菌株CH43的液體培養(yǎng)基先進(jìn)行粗提變鏈素Ⅰ，再將粗提物重溶于尿素后再置于Source 15RPC色譜柱進(jìn)行反相高效液相色譜分析，質(zhì)譜法測定相對分子質(zhì)量范圍，再送生物公司測序，此純化方法步驟簡單，樣品損失較少，受到后繼學(xué)者們的青睞。

Balakrishnan等[8-9]在2000年至2002年間發(fā)現(xiàn)了變鏈素N、M46、M19、H7，采用的是XAD系列離子交換樹脂（美國羅門哈斯公司）進(jìn)行色譜分離。2006年Nicolas等[12]發(fā)現(xiàn)了變鏈素H-29B，分離純化時采用的方法類似于變鏈素B-Ny266。具體方法為第1步使用XAD-7樹脂（弱極性大孔聚烷酯吸附樹脂）直接分離培養(yǎng)液，第2步采用疏水色譜Sep-PakR的tc-C18固相萃取柱進(jìn)行樣品純化和濃縮，第3步RP-HPLC純化，使用色譜分析柱C18。該學(xué)者的3步純化法提高了最終產(chǎn)物的純度（≥99.9%）。

RP-HPLC與常規(guī)的高效液相色譜相反，是流動相的極性大于固定相極性的色譜。變鏈素的研究者們在分離純化變鏈素的實驗中幾乎都采用了RPHPLC方法，只是采用的色譜分析柱的類型和色譜洗脫的條件不同，洗脫出活性物質(zhì)時流動相的體積分?jǐn)?shù)有所不同。Qi等[5]分離純化變鏈素Ⅲ采用的是Source15RPC色譜柱。洗脫體系為緩沖液A（0.1%TFA）和緩沖液B（0.085%TFA溶于80%甲醇），經(jīng)3次純化，在流動相B的體積分?jǐn)?shù)為90%左右洗脫出活性物質(zhì)，且3次純化的色譜圖在洗脫出活性峰的位置出現(xiàn)唯一的共同的獨立的峰，該學(xué)者推測此峰物質(zhì)即是純化了的變鏈素物質(zhì)。該研究小組分離純化變鏈素Ⅰ和Ⅳ時[6]的洗脫體系與上述類似，只將流動相B中的甲醇替換成乙腈，2次純化后變鏈素Ⅰ和Ⅳ分別在流動相B體積分?jǐn)?shù)為31.8%和34.8%時洗脫出來，同樣在色譜圖上觀察到2條色譜曲線含有共同的唯一的獨立峰。Robson等[13]于2007年分離純化出變鏈素K8，使用的是Phenomenex Jupiter C18分析柱（4.6mm×250mm），是用于反相分離和提純蛋白質(zhì)專用柱，線性洗脫55min，2次純化在流動相B（100%乙腈）體積分?jǐn)?shù)為35%時洗脫出活性峰，與變鏈素Ⅰ和Ⅳ的洗脫體積分?jǐn)?shù)相近。而在本實驗中，采用的是Angilent tc-C18（4.6mm×150mm）分析柱，洗脫體系為A（0.1%TFA），B（100%乙腈），線性洗脫30min，2次RP-HPLC純化，色譜圖上同樣在洗脫出活性物質(zhì)的位置出現(xiàn)共同的唯一的獨立峰，該活性峰（即圖3的peak 1）被洗脫時的流動相B的體積分?jǐn)?shù)為75%左右，可推測該峰物質(zhì)即為純化的變異鏈球菌臨床株1G產(chǎn)生的變鏈素。

上述反相高效液相色譜洗脫情況顯示，變鏈素經(jīng)色譜純化時，洗脫出活性物質(zhì)時流動相的體積分?jǐn)?shù)差異較大，分析其原因可能與不同變鏈素的性質(zhì)差異，色譜柱的選擇，洗脫體系和洗脫條件的不同有較大關(guān)系。但是RP-HPLC純化結(jié)果相同，即色譜圖上純化洗脫出的活性峰即是多次純化的共同的唯一獨立峰，提示只要洗脫條件不變，同一種變鏈素會在相同的洗脫體積分?jǐn)?shù)下被分離純化。

由于變鏈素具有不同種類和不同性質(zhì)，對于分離純化的樣品，尚沒有標(biāo)準(zhǔn)品可供鑒定。國內(nèi)外的研究僅以其產(chǎn)生的抑菌性能而鑒定，因為在變異鏈球菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)成分中，沒有其他成分具有抑菌性能。本實驗中，由于樣品經(jīng)過多次收集、凍干、再重現(xiàn)溶解這些過程，會有部分樣品丟失，因此純化后的變鏈素抑菌環(huán)反而小。

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