蔣文 邊莉 李瑰琦 馬麗菊 唐睿珠 何永文
(1.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔研究所,云南 昆明 650031;2.荊州市第一人民醫(yī)院 口腔科,湖北 荊州 434000;3.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 病理科,云南 昆明 650032)
高溫治療癌癥已在臨床上得到較廣泛應(yīng)用,并取得較滿意效果。近年研究發(fā)現(xiàn),臨床常規(guī)熱療(41~45℃)主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡治療腫瘤,但分子學(xué)機制尚未完全清楚。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是哺乳動物細(xì)胞漿內(nèi)的脂質(zhì)依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和死亡,可作為腫瘤治療靶點[1-2]。其家族成員PKC-δ在不同類型的細(xì)胞中、不同刺激作用下可發(fā)揮促凋亡或抗凋亡的功能[3-4]。但其在熱療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的作用尚待探索。因此,本研究以人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株為實驗對象,應(yīng)用PKC-δ的活化抑制劑Rottlerin研究熱誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡時PKC-δ的作用,以期為臨床腫瘤熱療提供新的治療思路。
人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,RPMI 1640培養(yǎng)基(Thermo公司,美國),PKC-δ抑制劑Rottlerin(Alexis公司,瑞士),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(Amresco公司,美國),PKC-δ抗體(BD公司,美國),羊抗鼠(Ⅱ抗)(KPL公司,美國),碘化丙啶(propidium iodide,PI)、Rhodamine 123及Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物研究所。電熱恒溫水浴箱(江蘇環(huán)保儀器廠),Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀(Beckman公司,美國)。DM LS2顯微鏡(Leica公司,德國),DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠),酶標(biāo)儀(One Lambda公司,美國)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中(加青霉素1×105U·L-1、鏈霉素1×102mg·L-1)37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。
1.2.2 細(xì)胞熱處理 取對數(shù)生長期且密度為培養(yǎng)瓶面積的80%~90%細(xì)胞用于實驗,分成2組,分別加入Rottlerin(DMSO配制,終濃度10 μmol·L-1)和等體積的DMSO預(yù)處理細(xì)胞30min。43℃水浴槽中加熱細(xì)胞0、40、80、120min。
1.2.3 凋亡率分析 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h,收獲細(xì)胞,1 000 r·min-1離心5min,4℃冷PBS洗滌2次,70%預(yù)冷乙醇重懸細(xì)胞4℃固定過夜,PBS洗滌后100μg·mL-1PI 4℃避光染色30min,流式細(xì)胞儀檢測DNA含量,以G0/G1前期亞二倍體峰為凋亡峰,計算細(xì)胞凋亡率。
1.2.4 Western雜交分析 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)4 h,收獲細(xì)胞,冰上裂解細(xì)胞15min,4℃ 12 000 r·min-1離心15min,提取全細(xì)胞溶解液,SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,加一抗PKC-δ,4℃孵育過夜,TBST洗滌,5 min×3次,加二抗室溫下孵育1 h,TBST洗滌,5min×3次,化學(xué)發(fā)光顯影。
1.2.5 線粒體膜電位分析 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h,參考文獻[5]的方法,終質(zhì)量濃度為10μg·mL-1Rhodamine 123與細(xì)胞共培養(yǎng)30 min,收獲細(xì)胞,PBS洗滌,流式細(xì)胞儀檢測熒光強度。
1.2.6 Caspase-3活性的檢測 細(xì)胞熱處理后常規(guī)培養(yǎng)16 h,收獲細(xì)胞,冰上裂解15min,提取全細(xì)胞溶解液,調(diào)整為相同蛋白濃度。取蛋白樣品40μL加入50μL檢測緩沖液中,再加入10μL無色的反應(yīng)底物Ac-DEVD-pNA,37℃孵育過夜。待測樣品液各100μL轉(zhuǎn)移至96孔板中,酶標(biāo)儀檢測空白對照液和8個待測樣品在波長為405 nm處的吸光度A值,以A405nm表示Caspase-3的相對活性。
1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間差異比較采用方差分析,兩組間差異比較采用LSD分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
熱處理后24 h,隨加熱時間延長,經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞凋亡率都逐漸增加(圖1)。
各加熱時間點2種方法預(yù)處理的細(xì)胞凋亡率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示,未加熱時經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞凋亡率無差異(P>0.05);加熱40、80、120min,2種方法預(yù)處理的細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.01,表1)。
表1 各組Tca8113細(xì)胞的凋亡率(n=3,%,±s)Tab 1 Apoptosis rate of Tca8113 cells induced by heating(n=3,%,±s)
表1 各組Tca8113細(xì)胞的凋亡率(n=3,%,±s)Tab 1 Apoptosis rate of Tca8113 cells induced by heating(n=3,%,±s)
細(xì)胞凋亡率0min 40min 80min 120min Tca8113-Rottlerin組 4.76±0.88 12.3±1.91 31.5±2.61 36.53±0.65 Tca8113-DMSO組 4.90±0.72 22.1±1.35 43.2±1.57 49.90±1.25 P值 P>0.05 P<0.01 P<0.01 P<0.01項目
未加熱時經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞,全長PKC-δ(7.8×104)表達明顯,4×104的催化片段(protein kinase C-δ catalytic fragment,PKC-δCF)無明顯表達;加熱40min后,經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理Tca8113細(xì)胞全長PKC-δ和PKC-δCF都表達,但未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞中PKC-δCF表達水平高于Rottlerin預(yù)處理的細(xì)胞(圖2)。以上結(jié)果說明加熱可裂解活化PKC-δ,Rottlerin能抑制熱誘導(dǎo)PKC-δ裂解活化。
隨熱處理時間延長,經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞弱熒光部分細(xì)胞含量都逐漸增高,但未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞較Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞更明顯。加熱40、80、120min,經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞的弱熒光細(xì)胞百分比經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01,圖3,表2)。
表2 各組Tca8113細(xì)胞弱熒光細(xì)胞百分比(n=3,%,±s)Tab 2 Percentage of hypofluorescence of Tca8113 cells induced by heat(n=3,%,±s)
表2 各組Tca8113細(xì)胞弱熒光細(xì)胞百分比(n=3,%,±s)Tab 2 Percentage of hypofluorescence of Tca8113 cells induced by heat(n=3,%,±s)
經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞A405nm值隨加熱時間的延長而逐漸增加,表明Caspase-3的活性隨加熱時間的延長而逐漸增加。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,未經(jīng)加熱處理,經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞A405nm值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),40、80、120min相同加熱時間,Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞的A405nm值低于未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理細(xì)胞的A值(P<0.01,表3)。
表3 各組Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對活性(n=3,±s)Tab 3 Relative activity of Caspaes-3 in Tca8113 cells(n=3,±s)
表3 各組Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對活性(n=3,±s)Tab 3 Relative activity of Caspaes-3 in Tca8113 cells(n=3,±s)
PKC-δ是新型PKC亞型的成員,廣泛存在于各種組織如腦組織和上皮組織細(xì)胞中,具有促凋亡作用。凋亡刺激激活的PKC-δ從胞漿轉(zhuǎn)移至亞細(xì)胞器,磷酸化相應(yīng)的底物,激活Caspase級聯(lián),最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡,而Rottlerin可抑制這一過程[4]。PKC-δ對細(xì)胞的生存有負(fù)面作用,PKC-δ可增強放療的凋亡誘導(dǎo)作用,提高放療的敏感性[6-7];阻斷PKC-δ的凋亡信號傳導(dǎo),可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增加對抗腫瘤藥物的抗拒性[8]。PKC-δ是凋亡因子誘導(dǎo)多種類型腫瘤細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑中的重要激酶。喜樹堿類似物NSC606985處理U937、NB4細(xì)胞,硼替佐米和三氧化二砷處理K562,都出現(xiàn)PKC-δ活化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10];FTY720可激活PKC-δ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制PKC-δ活化導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對FTY720的抗拒性增加[11];P53、P73和Fas受體缺乏的Hep3B細(xì)胞中,PKC-δ和c-Abl是阿霉素、順鉑、5-氟尿密啶誘導(dǎo)凋亡所需要的蛋白激酶[12];而Rottlerin或負(fù)顯性突變的PKC-δ可抑制這些凋亡因子誘導(dǎo)的PKC-δ活化及其誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生。
PKC-δ全酶長7.8×104,裂解活化后主要形成PKC-δ CF(4.0×104)和PKC-δ RF。PKC-δCF是結(jié)構(gòu)性的活化酶,對許多細(xì)胞類型有毒性作用;是強效力的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子,能觸發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C,激活Caspase,誘導(dǎo)核內(nèi)DNA片段化和細(xì)胞凋亡。研究[13]證實,熱誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡中,PKC-δ裂解活化,PKC-δCF的表達水平提高。本實驗結(jié)果顯示,加熱后PKC-δCF在Tca8113細(xì)胞中表達水平提高。但相同熱處理條件下,Rottlerin可抑制熱誘導(dǎo)的PKC-δ的裂解活化和降低細(xì)胞凋亡率。表明熱活化的PKC-δ可促進熱誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡。
線粒體是PKC-δ的作用靶位,激活的PKC-δ轉(zhuǎn)位線粒體,導(dǎo)致跨膜電位崩解和細(xì)胞色素C釋放,細(xì)胞凋亡發(fā)生,而Rottlerin可抑制PKC-δ活化,抑制PKC-δ誘發(fā)的跨膜電位崩解和細(xì)胞凋亡[7]。Rhodamine 123是一種活細(xì)胞線粒體的陽離子熒光染料,正常細(xì)胞Rhodamine123熒光強度高,凋亡細(xì)胞熒光強度減低,壞死細(xì)胞不能吸收Rhodamine 123,不發(fā)熒光。本實驗觀察到,Rottlerin預(yù)處理Tca8113細(xì)胞,43℃熱處理40、80、120min后24 h,其弱熒光細(xì)胞百分含量低于未經(jīng)Rottlerin處理的Tca8113細(xì)胞;而未加熱時兩者弱熒光細(xì)胞百分含量基本一致。本實驗結(jié)果顯示,Rottlerin可部分地抑制熱療誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞跨膜電位崩解,說明抑制PKC-δ裂解活化可抑制其誘發(fā)的跨膜電位崩解。
PKC-δ活化出現(xiàn)在凋亡信號途徑的早期,是線粒體凋亡途徑的上游事件。Caspase家族是凋亡途徑的主要執(zhí)行者,其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,是線粒體凋亡途徑的下游事件。PKC-δ激活是Caspase-3活化所必需的,Rottlerin或PKC-δ突變可抑制PKC-δ的激活,從而抑制其誘發(fā)的Caspase-3的活化,PKC-δ是Caspase-3的上游因子并調(diào)節(jié)其活性[14]。本實驗結(jié)果顯示,經(jīng)Rottlerin與未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對活性值比較,未加熱組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);相同熱處理條件下,經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞Caspase-3相對活性值低于未經(jīng)Rottlerin預(yù)處理的Tca8113細(xì)胞,統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P<0.01)。表明Rottlerin可降低熱誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞中Caspase-3的活性。
[1]Teicher BA.Protein kinase C as a therapeutic target[J].Clin Cancer Res,2006,12(18):5336-5345.
[2]El-Rayes BF,Ali S,Philip PA,et al.Protein kinase C:A target for therapy in pancreatic cancer[J].Pancreas,2008,36(4):346-352.
[3]Jackson DN,Foster DA.The enigmatic protein kinase Cdelta:Complex roles in cell proliferation and survival[J].FASEB J,2004,18(6):627-636.
[4]Brodie C,Blumberg PM.Regulation of cell apoptosis by protein kinase c delta[J].Apoptosis,2003,8(1):19-27.
[5]Sturm A,Itoh J,Jacobberger JW,et al.p53 negatively regulates intestinal immunity by delaying mucosal T cell cycling[J].J Clin Invest,2002,109(11):1481-1492.
[6]Lee YJ,Soh JW,Dean NM,et al.Protein kinase Cdelta overexpression enhances radiation sensitivity via extracellular regulated protein kinase 1/2 activation,abolishing the radiation-induced G(2)-M arrest[J].Cell Growth Differ,2002,13(5):237-246.
[7]Lee YS,Sohn KC,Kim KH,et al.Role of protein kinase C delta in X-ray-induced apoptosis of keratinocyte[J].Exp Dermatol,2009,18(1):50-56.
[8]Meinhardt G,Roth J,Totok G,et al.Signaling defect in the activation of caspase-3 and PKCdelta in human TUR leukemia cells is associated with resistance to apoptosis[J].Exp Cell Res,1999,247(2):534-542.
[9]Song MG,Gao SM,Du KM,et al.Nanomolar concentration of NSC606985,a camptothecin analog,induces leukemic-cell apoptosis through protein kinase Cdelta-dependent mechanisms[J].Blood,2005,105(9):3714-3721.
[10]Yan H,Wang YC,Li D,et al.Arsenic trioxide and proteasome inhibitor bortezomib synergistically induce apoptosis in leukemic cells:The role of protein kinase Cdelta[J].Leukemia,2007,21(7):1488-1495.
[11]Hung JH,Lu YS,Wang YC,et al.FTY720 induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through activation of protein kinase C delta signaling[J].Cancer Res,2008,68(4):1204-1212.
[12]Lasfer M,Davenne L,Vadrot N,et al.Protein kinase PKC delta and c-Abl are required for mitochondrial apoptosis induction by genotoxic stress in the absence of p53,p73 and Fas receptor[J].FEBS Lett,2006,580(11):2547-2552.
[13]Wada S,Cui ZG,Kondo T,et al.A hydrogen peroxide-generating agent,6-formylpterin,enhances heat-induced apoptosis[J].Int J Hyperthermia,2005,21(3):231-246.
[14]Day TW,Wu CH,Safa AR.Etoposide induces protein kinase Cdelta-and caspase-3-dependent apoptosis in neuroblastoma cancer cells[J].Mol Pharmacol,2009,76(3):632-640.