張朝良 孔祥麗 陳思秀 李小玉

（口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川大學(xué),四川 成都 610041）

牙周病是由以牙菌斑中的微生物為主，多種因素作用所引起的牙周支持組織慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因[1]。其臨床病理特點(diǎn)為牙周軟硬組織呈進(jìn)行性不可逆性的破壞。目前牙周病治療的最終目的是牙周組織的再生、重建和功能的恢復(fù)。牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）能合成和分泌大量膠原物質(zhì)，具有多向分化潛能，其前體細(xì)胞能分化出成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，維持牙周組織的相對(duì)穩(wěn)定，是牙周炎治療后牙周新附著形成的主要細(xì)胞來源，是牙周組織再生的基礎(chǔ)。目前研究[2]表明，多種生長因子對(duì)PDLCs增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成有促進(jìn)作用。

中藥黃芪的活性成分黃芪多糖對(duì)成骨細(xì)胞的體外增殖與分化具有一定作用。黃芪化學(xué)成分眾多，主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類以及氨基酸類等。黃芪中多糖含量為2.53%，相對(duì)分子質(zhì)量為1萬～5萬。黃芪水提取液中含有3種黃芪多糖（Astragalus membranaceus，APS），即APSⅠ、Ⅱ、Ⅲ。其中APSⅠ是雜多糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量36 300，APSⅡ、Ⅲ均為葡聚糖[3]。因此，本文通過體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，觀察黃芪多糖對(duì)其增殖、分化能力以及結(jié)構(gòu)的影響，以期為口腔生物工程細(xì)胞培養(yǎng)提供有效的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），小牛血清（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司，美國），多聚甲醛、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）等均購于鄭州化學(xué)試劑三廠。CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國），倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.2 人牙周膜細(xì)胞體外分離培養(yǎng)

在臨床上取得因正畸拔除的健康牙，置含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，立即送到實(shí)驗(yàn)室，在無菌條件下將牙放入雙抗中5～10min，取出在培養(yǎng)皿里除去其他牙齦組織；用PBS洗2次，再用刀片刮取根中部1/3的牙周膜組織，用0.1%Ⅰ型膠原酶3mL沖洗后吸入25mL培養(yǎng)瓶里，置37℃水浴搖床中振搖90min，顯微鏡下觀察有大量細(xì)胞游離出來，立即終止消化即加8mL DMEM培養(yǎng)基混勻，吸入離心管中，封口，1 000 r·min-1，離心8min；取出，棄上清，用含20%胎牛血清DMEM 1mL稀釋，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至每毫升5×106個(gè)細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶里，10 d后換液，以后每3 d換1次液，20 d后，顯微鏡下觀察有牙周膜細(xì)胞貼壁生長；25 d后，用0.25%胰酶原瓶傳代1次，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)80%再傳代[4]。

1.3 牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)特性及鑒定

1.3.1 常規(guī)觀察 選擇原代牙周膜細(xì)胞及第3代對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 免疫組化鑒定 取第4代培養(yǎng)細(xì)胞爬片，用免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白及細(xì)胞角蛋白免疫組化染色。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞原代及傳代后情況。細(xì)胞傳至5代時(shí)，制成每毫升1×105個(gè)的細(xì)胞懸液并制備細(xì)胞爬片。然后按ABC法操作、DAB顯色，分別進(jìn)行波絲蛋白、角蛋白的免疫組織化學(xué)染色，以PBS代替抗體作為陰性對(duì)照組，顯微鏡下觀察染色結(jié)果[5]。

1.4 黃芪多糖對(duì)牙周膜細(xì)胞的影響

1.4.1 黃芪多糖對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖的影響 牙周膜細(xì)胞按每毫升2×104個(gè)，每孔0.5mL加入24孔板后，換加入APS的含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔0.5mL，使APS最終質(zhì)量濃度分別為0.08、0.1、0.2、0.4mg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3.5 h，各孔加40 μL的MTT（5 mg·mL-1），37 ℃ ，5%CO2條件下孵育3.5h，棄培養(yǎng)液，各孔加DMSO溶液0.45mL，振搖5min，靜置0.5 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570 nm波長處吸光度值。

1.4.2 黃芪多糖對(duì)人牙周膜細(xì)胞合成堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的影響 試驗(yàn)分為4組：分別加有0.08、0.1、0.2、0.4 mg·mL-1黃芪多糖DMEM培養(yǎng)液，不含黃芪多糖DMEM培養(yǎng)液為對(duì)照組，將人牙周膜細(xì)胞調(diào)整密度至每毫升0.5×105個(gè)的細(xì)胞懸液后，按每孔1mL接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，棄去孔內(nèi)液體，用PBS液漂洗每孔3遍，用TritonX-100裂解細(xì)胞，然后按照ALP試劑盒檢測(cè)人牙周膜細(xì)胞內(nèi)ALP的合成情況，酶標(biāo)儀上450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.4.3 黃芪多糖對(duì)牙周膜細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的影響 將對(duì)照組牙周膜細(xì)胞和適宜黃芪多糖質(zhì)量濃度組牙周膜細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種到預(yù)先放有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，3 d后取出蓋玻片，固定、脫水、臨界點(diǎn)干燥、鍍金，掃描電鏡下觀察。

1.4.4 黃芪多糖對(duì)牙周膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 用0.25%的胰蛋白酶消化對(duì)照組和適宜黃芪多糖質(zhì)量濃度組牙周膜細(xì)胞，分別收集于離心管中，15 000 r·min-1離心15min，棄上清，用2%戊二醛固定細(xì)胞團(tuán)塊2 h，丙酮梯度脫水，真空干燥，以Epon812包埋，超薄切片后透射電鏡觀察。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Origin 8.0軟件完成統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜細(xì)胞的生長與鑒定

培養(yǎng)10～15 d，有細(xì)胞從組織塊周圍游出（圖1A），成梭形，傳代3代后細(xì)胞生長旺盛，均為梭形，周圍有數(shù)個(gè)長短不等的突起，中央有圓形或卵圓形的胞核（圖1B）。波形絲蛋白和角蛋白染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞波絲蛋白染色陽性，細(xì)胞胞漿棕黃色著色（圖1C），角蛋白染色陰性（圖1D），證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為中胚層來源的細(xì)胞[6]，且無上皮來源細(xì)胞的混雜，符合牙周膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)特征。結(jié)果表明運(yùn)用消化-組織塊法培養(yǎng)獲得人牙周膜細(xì)胞，細(xì)胞來源可靠，生長狀態(tài)良好，可作為體外的細(xì)胞模型用于進(jìn)一步研究黃芪多糖對(duì)其功能的調(diào)控作用。

2.2 黃芪多糖對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖和ALP表達(dá)的影響

APS質(zhì)量濃度在0.1～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)，對(duì)PDLCs的增殖有促進(jìn)作用，0.2mg·mL-1時(shí)作用最強(qiáng)，此后質(zhì)量濃度增高反而有抑制作用（圖2）。從0.1mg·mL-1質(zhì)量濃度開始，對(duì)ALP表達(dá)有促進(jìn)作用，但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4mg·mL-1時(shí)，同樣表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P＜0.05，圖3）。

2.3 黃芪多糖對(duì)牙周膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

牙周膜細(xì)胞呈長梭形和多角型，較扁平，細(xì)胞表面有細(xì)小的絨毛和皺褶，細(xì)胞在貼壁生長時(shí)生出偽足并黏附（圖4A），生長在含有黃芪多糖的培養(yǎng)基中的牙周膜細(xì)胞分泌大量的基質(zhì)沉積于細(xì)胞周圍（圖4B）。對(duì)照組牙周膜細(xì)胞生長良好，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，胞質(zhì)中見豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基器及線粒體等，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核核仁明顯，常染色質(zhì)豐富，部分線粒體腫脹（圖5A）。含黃芪多糖培養(yǎng)基中，可見牙周膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量腫脹的線粒體（圖5B）。

3 討論

近年來，牙周袋內(nèi)局部用藥特別是應(yīng)用中草藥越來越引起人們的重視。黃芪味甘，性溫，有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、排膿、利水消腫和生肌等功效。臨床用黃芪為主藥治療多種疾病，能明顯地促進(jìn)免疫功能的活性，對(duì)骨質(zhì)疏松有顯著療效，因而對(duì)骨細(xì)胞的生長作用近年來也為人們所重視[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)觀察不同質(zhì)量濃度梯度的APS對(duì)PDLCs的增殖作用。MTT檢測(cè)法是檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法，主要反映細(xì)胞的能量代謝。結(jié)果表明0.2mg·mL-1的APS對(duì)PDLCs的增殖具有明顯促進(jìn)作用（P＜0.05），而高質(zhì)量濃度的APS（0.4mg·mL-1）對(duì)牙周膜細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用（P＜0.05）。

體外培養(yǎng)的PDLCs至少存在2種表型：成纖維細(xì)胞表型和成骨細(xì)胞表型，前者具有較強(qiáng)的合成膠原的能力，后者能發(fā)育為成骨細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞，是牙周組織再生修復(fù)并形成新附著的重要成分[9]。ALP是一種細(xì)胞膜相關(guān)的糖蛋白，在礦化組織細(xì)胞中高表達(dá)，為成骨細(xì)胞的一種特異表型，能水解磷酸酯，為羥磷灰石的沉積提供必需的磷酸，同時(shí)水解焦磷酸鹽，解除其對(duì)骨鈣化形成的抑制作用，有利于骨的形成。本研究在含有0.2mg·mL-1黃芪多糖的培養(yǎng)基中，PDLCs堿性磷酸酶的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示其有促進(jìn)牙槽骨形成的作用。

在本研究中，生長在含有APS培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)良好、分泌大量的基質(zhì)沉積于細(xì)胞周圍，無細(xì)胞衰老及異常分裂現(xiàn)象；從超微結(jié)構(gòu)上看，黃芪能使細(xì)胞生理代謝作用增強(qiáng)，細(xì)胞線粒體數(shù)目增多，體積明顯增大，表明細(xì)胞在分裂增殖和生物學(xué)功能方面處于非?；钴S的狀態(tài)。由此可見，適宜質(zhì)量濃度APS可促進(jìn)體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞的生長和分化，有利于細(xì)胞的增殖。

牙周組織的修復(fù)是多因素、多方面、多種因子共同調(diào)控下完成的。對(duì)影響牙周組織細(xì)胞的因子還知之甚少，已知因子對(duì)牙周組織細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的了解還尚不完全，本實(shí)驗(yàn)條件下，0.2mg·mL-1APS為牙周膜細(xì)胞較適宜的作用質(zhì)量濃度，以此作用于體外培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞是口腔組織工程種子細(xì)胞體外培養(yǎng)的有益嘗試。

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