陳世坤 胡建章 韓曉麗 徐國(guó)興

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IFN-γ在小鼠真菌性角膜炎中的表達(dá)

陳世坤 胡建章 韓曉麗 徐國(guó)興

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科中心

目的：通過(guò)檢測(cè)IFN-γ及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet在小鼠真菌性角膜炎中的表達(dá)水平，探討機(jī)體免疫在該病發(fā)展中的作用。 方法：應(yīng)用角膜表層鏡法建立小鼠真菌性角膜炎模型，在感染后第1、3、5、7天，觀察角膜炎特點(diǎn)與病理變化；半定量RT-PCR和ELISA檢測(cè)角膜中IFN-γ的表達(dá)，半定量RT-PCR檢測(cè)T-bet的表達(dá)。結(jié)果：角膜接種菌液后，角膜浸潤(rùn)混濁進(jìn)行性加重；HE染色可見早期在角膜及前房中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；RT-PCR與ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，IFN-γ在角膜接種菌液后均出現(xiàn)表達(dá)，在第3天達(dá)最高值，而后逐漸降低；T-bet 在第3天達(dá)最高值；T-bet mRNA的表達(dá)與IFN-γ呈正相關(guān)(<0.05)。結(jié)論：在真菌性角膜炎中，Th1型免疫應(yīng)答在調(diào)節(jié)機(jī)體的抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用。

真菌性角膜炎 IFN-γ 免疫應(yīng)答

已知致病性真菌侵入機(jī)體后，首先啟動(dòng)非特異性免疫反應(yīng)，TH1細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ等TH1型細(xì)胞因子，激活或提高吞噬細(xì)胞的抗真菌能力[1]。本研究通過(guò)建立Balb/c小鼠的真菌性角膜炎模型，觀察其臨床特征、病理特點(diǎn)的變化，檢測(cè)Th1細(xì)胞因子（IFN-γ）及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，以探討Th1細(xì)胞應(yīng)答在真菌性角膜炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立

選用近交系Balb/c小鼠，6~8周齡；菌種選用標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮刀菌，調(diào)整孢子接種濃度為1×106CFU/ml。采用表層鏡法建立小鼠真菌性角膜炎模型[2]。

1.2 潰瘍刮片鏡檢與培養(yǎng)。在拆除眼瞼縫線當(dāng)天，隨機(jī)選取3只小鼠，刮取其角膜潰瘍?cè)?，分別進(jìn)行涂片查菌絲、真菌培養(yǎng)和細(xì)菌培養(yǎng)。

1.3 角膜炎形態(tài)觀察。角膜接種菌液后第1、3、5、7天，裂隙燈顯微鏡觀察角膜炎癥變化及其病變特點(diǎn)，如角膜混濁的面積、密度和表面的規(guī)則性等。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。角膜接種菌液后第1、3、5、7天，自各組中隨機(jī)選取角膜感染成功的小鼠：（1）2只進(jìn)行石蠟包埋，待行HE染色組織病理學(xué)檢查；（2）6只在分別待行Rt-PCR和ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.5 組織病理學(xué)檢查。角膜組織切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察角膜病理變化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.6 半定量RT-PCR檢測(cè)IFN-γ與T-bet 基因mRNA的表達(dá)。

1.7 ELISA檢測(cè)IFN-γ的表達(dá)。按照試劑盒步驟進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有統(tǒng)計(jì)均在SPSS11.5軟件上運(yùn)行，組內(nèi) 或組間的比較采用檢驗(yàn)或單因素方差分析（兩兩比較采用SNK法），T-bet mRNA與IFN-γ的關(guān)系采用直線相關(guān)回歸分析。以<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 潰瘍刮片鏡檢與培養(yǎng)

小鼠角膜潰瘍處刮片后采用10％KOH濕片法均可查見菌絲，真菌培養(yǎng)全部陽(yáng)性，菌種鑒定均為原感染菌，細(xì)菌培養(yǎng)全部陰性。

2.2 角膜炎形態(tài)

接種菌液后第1天表現(xiàn)為角膜淺層輕度浸潤(rùn)水腫；以后表淺浸潤(rùn)加重，出現(xiàn)黃白色或灰黃色潰瘍?cè)?；?天角膜致密混濁，周邊角膜新生血管大量生長(zhǎng)。

2.3 HE染色

接種菌液后第1、3天可見角膜基質(zhì)及前房有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，第5天炎癥細(xì)胞有所減少，周邊可見新生血管，角膜基質(zhì)中纖維細(xì)胞逐漸增多。

2.4 角膜中IFN-γ的表達(dá)

RT-PCR及ELISA對(duì)角膜中IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果表明，在正常角膜中幾乎未見表達(dá)，而角膜接種菌液后的第1、3天呈高表達(dá)，以后逐漸表達(dá)減弱。

2.5 角膜中T-bet基因mRNA的表達(dá)及其與IFN-γ的相關(guān)性

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，T-bet 基因mRNA在角膜接種菌液后開始表達(dá)，第3天達(dá)最高值，而后逐漸降低。

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在小鼠真菌性角膜炎發(fā)展過(guò)程中，角膜中T-bet 基因mRNA的表達(dá)與IFN-γ呈正相關(guān)(=0.645，<0.05)。

3 討論

已知， Thl細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，引起前炎癥細(xì)胞因子（IL-12、IFN-γ，等）的產(chǎn)生，殺滅病原體，與保護(hù)性炎癥反應(yīng)有關(guān)[3,4]。研究表明，IFN-γ主要由Thl型細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)吞噬細(xì)胞和Thl的增殖、活化[5]。本研究中，在角膜感染真菌后，迅速出現(xiàn)IFN-γ的表達(dá)，表明Thl型免疫應(yīng)答積極參與調(diào)節(jié)機(jī)體的抗真菌免疫，且真菌性角膜炎的病程發(fā)展與抗真菌免疫平衡密切相關(guān)。

本研究顯示，IFN-γ在感染初期呈高表達(dá)，表明角膜感染真菌后，迅速啟動(dòng)非特異性免疫反應(yīng)，激活炎性細(xì)胞并分泌炎性因子以抵御真菌。在感染后第3天，IFN-γ表達(dá)達(dá)到最高，提示機(jī)體的免疫力可能達(dá)最強(qiáng)。此時(shí)角膜浸潤(rùn)混濁正進(jìn)行性加重，在角膜緣、角膜基質(zhì)及前房中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明機(jī)體正處于急性感染期。隨著病程發(fā)展，IFN-γ水平逐漸降低，相對(duì)應(yīng)的臨床表現(xiàn)是角膜中炎癥細(xì)胞逐漸減少，周邊大量新生血管生長(zhǎng)。我們推測(cè)，Balb/c小鼠角膜感染真菌后，機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，以控制和清除真菌的感染。

T-bet是Thl細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能選擇性地表達(dá)于Thl細(xì)胞，與IFN-γ基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，正調(diào)節(jié)Thl型細(xì)胞因子，是決定Thl極性分化的關(guān)鍵因素[3]。T-bet的表達(dá)水平反應(yīng)了Thl免疫水平。本研究中，T-bet 基因mRNA的表達(dá)與IFN-γ相一致，支持我們對(duì)小鼠角膜抗真菌免疫的推測(cè)。

[1] Cenci E, Mencacci A, Spaccapelo R,et al. T helper cell type 1 (Th1)- and Th2-like responses are present in mice with gastric candidiasis but protective immunity is associated with Th1 development[J]. J Infect Dis, 1995,171:1279-1288.

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福建省科技廳青年人才項(xiàng)目（2008F3041），福建醫(yī)科大學(xué)教授發(fā)展基金（2006-js6033；js09009），福建省衛(wèi)生廳青年科研基金（2007-2-1;2008-2-18）。

徐國(guó)興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。