徐 巍 郭 健 徐國(guó)興

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在視網(wǎng)膜疾病研究中的應(yīng)用

徐 巍 郭 健 徐國(guó)興

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省眼科研究所

視網(wǎng)膜疾病是眼科疾病研究中的難點(diǎn)，也是致盲的重要原因。多種原因引起的視網(wǎng)膜疾病的共同結(jié)果是光感受器細(xì)胞或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變性壞死。當(dāng)前對(duì)壞死的視神經(jīng)細(xì)胞缺乏有效治療措施。因此，利用干細(xì)胞，尤其是具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Marrow Mesenchymal Stem Cells, MSCs），誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞；恢復(fù)和重建視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能有望成為視網(wǎng)膜疾病治療的新途徑。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 可塑性 視網(wǎng)膜

視網(wǎng)膜是由視網(wǎng)膜色素上皮層和神經(jīng)感覺(jué)層組成的對(duì)光敏感且精細(xì)的膜樣結(jié)構(gòu)，是視覺(jué)形成的基礎(chǔ)。任何原因引起的視網(wǎng)膜血管，神經(jīng)感覺(jué)組織和色素上皮的病變均可導(dǎo)致視力損傷，甚至致盲。各種原因引起的視網(wǎng)膜疾病的最終結(jié)果都是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的壞死或凋亡，造成不可逆的損傷，如：視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration, AMD）等。雖然目前有多種治療方法，但療效均欠佳。隨著干細(xì)胞研究的深入，利用干細(xì)胞，尤其是MSCs，誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜各種細(xì)胞，恢復(fù)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能可能有望成為新的治療途徑。

干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有分化的全能性，可分化成為各種類(lèi)型的細(xì)胞[1]。利用胚胎干細(xì)胞移植入受損部位可使組織再生恢復(fù)功能。已有報(bào)道指出胚胎干細(xì)胞可以向視網(wǎng)膜前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化[2]。胚胎干細(xì)胞對(duì)于視網(wǎng)膜變性疾病的治療有很大潛力，但是由于胚胎干細(xì)胞的研究在倫理方面存在很大爭(zhēng)議。此外，胚胎干細(xì)胞的MHC-Ⅰ類(lèi)分子隨細(xì)胞分化而不斷增加，使其排斥反應(yīng)成為限制其應(yīng)用的一個(gè)重要問(wèn)題。成體干細(xì)胞是存在于個(gè)體組織中的具有多向或單向分化的潛能，廣泛存在于骨髓、肝臟、心肌、腦、及視網(wǎng)膜等組織中。在特定情況下，如組織損傷等，可增殖分化修復(fù)受損的組織。各種成體干細(xì)胞中，以MSCs具有多向分化潛能，可分化成為包括骨、軟骨、脂肪細(xì)胞、筋膜、肌肉及骨髓基質(zhì)等[3]，而成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。此外，MSCs克服了胚胎干細(xì)胞的缺點(diǎn)，來(lái)源豐富，取材方便，易于分離純化，可塑性強(qiáng)且不存在倫理學(xué)問(wèn)題。

1 MSCs概述

1867年Cohnheim在研究損傷修復(fù)時(shí)，利用可溶性苯胺染料經(jīng)靜脈注射后發(fā)現(xiàn)染料出現(xiàn)在遠(yuǎn)端受損修復(fù)部位的細(xì)胞中。并由此推測(cè)損傷部位的細(xì)胞是來(lái)自血液的，而且很可能來(lái)自骨髓。雖然這一推斷至今尚未得到證實(shí)，但是最近的研究證實(shí)骨髓中確實(shí)存在一種不同于造血干細(xì)胞且具有多向分化潛能的干細(xì)胞，即MSCs。

1.1 MSCs的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)

MSCs除具有細(xì)胞核漿比值大，細(xì)胞器少等干細(xì)胞的一般形態(tài)學(xué)特點(diǎn)外，還有細(xì)胞呈梭形，粘附能力強(qiáng)，每2~4個(gè)細(xì)胞可形成一個(gè)集落單元[4]。MSCs分裂周期在33h左右，具有較強(qiáng)的分裂能力。體外培養(yǎng)的MSCs經(jīng)過(guò)20~30次的細(xì)胞倍增后，應(yīng)用帶微孔的膠囊將其包繞并植入鼠的腹膜，可發(fā)現(xiàn)MSCs仍可分化成為纖維、骨、軟骨等組織[5]。

1.2 MSCs的免疫標(biāo)志物

利用流式細(xì)胞儀分析顯示，MSCs大多數(shù)可表達(dá)SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等。MSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志物，包括脂多糖受體CD14、CD34以及白細(xì)胞的一般標(biāo)志物CD45[3]。所以目前認(rèn)為可以把CD44、CD105、CD106等骨髓細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性等作為MSCs免疫學(xué)鑒定方法。

1.3 MSCs誘導(dǎo)分化的分子因素

作為間質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞，MSCs具有多向分化潛能且分化的方向視誘導(dǎo)因素的不同而各異。MSCs分化過(guò)程中涉及多種細(xì)胞因子。各種細(xì)胞因子的作用方式和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程也不同。其中，受體酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）可從細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化等方面調(diào)控細(xì)胞。過(guò)程包括配體—受體的結(jié)合，受體磷酸化并活化下游分子，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化等發(fā)揮重要作用[6]。影響MSCs生長(zhǎng)分化的蛋白質(zhì)分子包括多種生長(zhǎng)因子分子，如BMP,activin等，和多種類(lèi)型的白介素。這些分子通過(guò)不同時(shí)相和濃度作用于MSCs，使其生長(zhǎng)并向多種細(xì)胞類(lèi)型分化。Irina Kratchmarova等[6]，在研究多種細(xì)胞因子對(duì)MSCs對(duì)分化的作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)hMSCs分化成為骨樣細(xì)胞是表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）刺激產(chǎn)生的，而不是血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor, PDGF）。多數(shù)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白可同時(shí)傳導(dǎo)兩種配體的刺激信號(hào)，但是磷酯酰肌醇激酶３（PI3K）途徑卻是單獨(dú)由PDGF激活的。利用PI3K的抑制劑可以使PDGF誘導(dǎo)分化的效應(yīng)回退。這表明該途徑可能是一個(gè)細(xì)胞分化的控制點(diǎn)。此外，Runx2與PPARγ是調(diào)節(jié)MSCs分化的的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)以上兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的活化分別驅(qū)動(dòng)MSCs分化成為骨母細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。同時(shí)，14-3-3結(jié)合蛋白TAZ對(duì)Rux2與PPARγ依賴(lài)性基因有分別共同激活和抑制的作用。MSCs的分化分子機(jī)制復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行全面的研究有助于成功誘導(dǎo)MSCs分化成為目的細(xì)胞。

2 MSCs在視網(wǎng)膜疾病研究中的應(yīng)用

多種試驗(yàn)已證實(shí)MSCs可以分化成為包括視網(wǎng)膜的各種細(xì)胞在內(nèi)的多種類(lèi)型組織細(xì)胞或前體細(xì)胞。由于視網(wǎng)膜是由RPE、光感受器細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等組成。RPE和神經(jīng)感覺(jué)層的細(xì)胞分別由胚胎發(fā)育時(shí)的神經(jīng)外胚葉的外層和內(nèi)層發(fā)育而來(lái)，各種細(xì)胞高度分化。因此，要實(shí)現(xiàn)將MSCs成功誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞就需要不同的誘導(dǎo)條件。當(dāng)前對(duì)于MSCs在視網(wǎng)膜疾病研究中的應(yīng)用，大體是通過(guò)兩條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即體外培養(yǎng)誘導(dǎo)和眼內(nèi)移植。兩條途徑各有優(yōu)缺點(diǎn)。利用體外誘導(dǎo)可以通過(guò)人工添加各種生長(zhǎng)因子等，明確各種蛋白質(zhì)分子對(duì)MSCs誘導(dǎo)的作用。培養(yǎng)液中成分明確便于分析，但是在尚未明確MSCs分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的機(jī)制之前，體外培養(yǎng)無(wú)法準(zhǔn)確誘導(dǎo)MSCs分成特定類(lèi)型的細(xì)胞或前體細(xì)胞；成功誘導(dǎo)較為困難。與體外培養(yǎng)相反MSCs移植則可以應(yīng)用體內(nèi)適于MSCs分化的微環(huán)境誘導(dǎo)其分化成為特定類(lèi)型的細(xì)胞或前體細(xì)胞。甚至某些分化的細(xì)胞可具有部分功能。但是眼內(nèi)移植同樣存在缺點(diǎn)。如體內(nèi)微環(huán)境復(fù)雜，存在多種促進(jìn)或抑制分化的因素。此外，復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境對(duì)于MSCs誘導(dǎo)因素的分析同樣是存在困難的。

2.1 細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)

檢測(cè)MSCs是否被誘導(dǎo)成為目的細(xì)胞需要一定的檢測(cè)指標(biāo)。而在細(xì)胞類(lèi)型的檢測(cè)中，免疫標(biāo)志物是較為可靠的指標(biāo)，且在成為功能細(xì)胞前即可出現(xiàn)。幾種視網(wǎng)膜細(xì)胞具有各自的標(biāo)志物，RPE，可表達(dá)角蛋白、RPE65等，光感受器細(xì)胞表達(dá)視紫紅質(zhì)、視蛋白等。神經(jīng)節(jié)前體細(xì)胞則可表達(dá)巢蛋白。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)膠質(zhì)酸性纖維蛋白等。所以當(dāng)前對(duì)于MSCs誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜各細(xì)胞的研究也多采用這些標(biāo)志物作為初步檢測(cè)指標(biāo)。而在功能檢測(cè)方面，RPE常檢測(cè)其是否形成色素或類(lèi)似色素的顆粒。神經(jīng)細(xì)胞則應(yīng)用到電生理，如膜片鉗等技術(shù)等；或是檢測(cè)是否存在突觸囊泡等。

2.2 MSCs誘導(dǎo)成為視網(wǎng)膜各細(xì)胞的關(guān)鍵

由于視網(wǎng)膜各種細(xì)胞高度分化，故利用MSCs誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞需詳盡了解誘導(dǎo)過(guò)程的關(guān)鍵因素。當(dāng)前多數(shù)研究是將MSCs與特定細(xì)胞共培養(yǎng)并適當(dāng)添加生長(zhǎng)因子或利用體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)。這些方法尚不能把誘導(dǎo)過(guò)程的關(guān)鍵因子一一闡明，但眼的發(fā)育過(guò)程為我們提供了可能與誘導(dǎo)過(guò)程存在密切關(guān)系的某些因子。

RPE的形成與TGFβ的超家族成員BMP和activin存在密切關(guān)系[7]，其中BMP對(duì)RPE的正確發(fā)育有重要作用。因?yàn)镹oggin的過(guò)渡表達(dá)可導(dǎo)致區(qū)域特異性的RPE完整性缺損[8]。神經(jīng)視網(wǎng)膜可由視杯的神經(jīng)上皮發(fā)育而來(lái)或由RPE轉(zhuǎn)分化形成，F(xiàn)GF家族成員的分子對(duì)分化的兩條途徑均有重要作用[9]。bFGF可使神經(jīng)上皮向神經(jīng)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)換[10]，而胚鼠RPE中FGF9的表達(dá)則可使RPE向神經(jīng)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)變[11]。而在光感受器發(fā)育時(shí)兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，視網(wǎng)膜鏈氨基酸拉鏈（Nlz）和核受體（Nrze3）可以調(diào)節(jié)視桿細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制視錐細(xì)胞相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[12]。二者的同時(shí)缺失則可使視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向視錐細(xì)胞分化[13]。

2.3 體外培養(yǎng)誘導(dǎo)MSCs向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化

Urs Vossmerbaeumer等[14]利用RPE條件培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs，通過(guò)研究添加血管活性腸肽（VIP）是否可以調(diào)節(jié)MSCs的分化進(jìn)程時(shí)發(fā)現(xiàn)MSCs可以表達(dá)RPE的某些特異性標(biāo)志物，如：bestrophin,角蛋白8,18以及RPE65等；而且在進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用促黑素（MSH）可以刺激已分化的MSCs表達(dá)色素顆粒，這些結(jié)果表明MSCs具有向神經(jīng)外胚層分化的潛能，可以產(chǎn)生具有RPE特性的細(xì)胞表型且具有一定得功能。有學(xué)者利用鼠MSCs與不同發(fā)育時(shí)相的神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞（RPC）共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與EB.5RPC共培養(yǎng)3d后的MSCs表現(xiàn)出神經(jīng)元樣外觀，膜出現(xiàn)突起的結(jié)構(gòu)。利用RT-PCR 和免疫熒光可檢測(cè)到Pax6,Brn36和巢蛋白表達(dá)，如果將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到7d或14d則無(wú)法檢測(cè)到Pax6,Brn36的表達(dá)，而且在14d的培養(yǎng)后MSCs恢復(fù)原來(lái)的梭形外觀，由此認(rèn)為MSCs自身可能存在著反饋調(diào)節(jié)，可以再一定程度抑制其分化，以維持干細(xì)胞的特性。

CD90----+的MSCs的可塑性已被多種實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD90+的MSCs可被包括?；撬?、actinvin A、和EGF在內(nèi)的多種介質(zhì)誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞樣的細(xì)胞。被誘導(dǎo)的MSCs中30%可表達(dá)光感受器細(xì)胞的特異性標(biāo)志物RHOS；同樣也有30%的細(xì)胞可表達(dá)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的標(biāo)志物CRABP1。另外尚有少數(shù)細(xì)胞可被這三種介質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)巢蛋白。

2.4 MSCs移植誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)細(xì)胞

多數(shù)MSCs體外移植治療視網(wǎng)膜疾病研究的途徑是利用分離培養(yǎng)的MSCs經(jīng)視網(wǎng)膜下腔注射。有學(xué)者用GFP或BrdU標(biāo)記CD90+的MSCs后注射入成年RCS鼠視網(wǎng)膜下腔。2W后發(fā)現(xiàn)CD90+的MSCs與宿主視網(wǎng)膜整合形成類(lèi)似光感細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞可出現(xiàn)Opsin、RHOS、突觸囊泡等，而分裂期細(xì)胞標(biāo)志物PCNA并未測(cè)得。這表明細(xì)胞是進(jìn)行了分化而不是分裂，這一結(jié)果證實(shí)MSCs可以分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞.該研究為視網(wǎng)膜變性病變的細(xì)胞療法的研究提供了良好的前景和研究途徑。

Wang.S等[15]利用RCS鼠的MSCs分別通過(guò)尾靜脈和視網(wǎng)膜下腔途徑對(duì)同基因鼠進(jìn)行注射后，在不同時(shí)相進(jìn)行光感細(xì)胞血管功能形態(tài)學(xué)方面的檢查，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下腔注射后可以很大程度上挽救視網(wǎng)膜的形態(tài)和功能，而經(jīng)尾靜脈注射則可對(duì)整個(gè)視網(wǎng)膜的光感細(xì)胞有挽救作用，兩條途徑結(jié)合則可以同時(shí)挽救光感細(xì)胞和視覺(jué)功能。

3 問(wèn)題與展望

干細(xì)胞研究是當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。利用MSCs誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞，可以為多種視網(wǎng)膜變性疾病帶來(lái)希望，但是MSCs很難按預(yù)定方向分化，為此,需要從分子水平闡明MSCs分化過(guò)程的關(guān)鍵因子，并結(jié)合最新的組織工程技術(shù)從多方面研究MSCs的分化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)其定向誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜各種細(xì)胞。在此過(guò)程中需要研究人員的不斷探索。

[1] Smith AG. Embryo-derived stem cells Of mice and men[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2001. 17, 435-462.

[2] Meyer JS, Katz ML, Maruniak JA, Kirk MD. Embryonic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptors[J]. Stem Cells. 2006.24, 274-283.

[3] Pittenger MF,Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science. 1999.284, 143-147.

[4] Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J]. Exp Hematol. 1976. 4, 267-274.

[5] Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers[J]. Cell Tissue Kinet. 1987. 20, 263-272.

[6] Irina K, Blagoy B, Mandana HS, Moustapha K, et al. Matthias M. Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation[J]. Science. 2005. 308, 1472 – 1477.

[7] Mshiri A, Close J, Reh TA. Retinal stem cells and regeneration[J]. Int.. J. Dev. Biol. 2004. 48, 1003-1014.

[8] Adler R, Beleckly TL. The role of bone morphogenetic proteins in the differetiation of the ventral optic cup. Development[J]. 2002. 129, 3161-3171.

[9] Araki M. Regeneratiaon of amphibian retina: role of tissue interaction and related signaling molecules on RPE transdifferetiation[J]. Dev. Growth differ. 2007. 49, 109-120.

[10] Pittack C, Grunwald GB, Reh TA. Fibroblast growth factors are necessary for neural retina but not pigmented epithelium differentiation in chick embryos[J]. Development. 1997. 124, 805-816.

[11] Zhao S, Hung FC, Colvin JS, et al.Patterning the optic neuroepithelium by FGF singaling and Ras activation[J].Development.2001.128, 5051-5060.

[12] Chen J, Rattner A, Nathans J. The rod photoreceptor-specific nuclear receptor Nr2e3 responses transcription of mutiple cone-specific genes[J]. J. Neurosci. 2005. 25, 118-129.

[13] Roberts MR, Hendrickson A, McGuire CR, et al. Retiniod X receptor (gamma) is necessary to establish the s-opsin gradient in cone receptors of the developing mouse retina[J]. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. 46, 2897-2904.

[14] Urs Vossmerbaeumer, Stefanie Ohnesorge, et al. Retinal pigment epithelial phenotype induced in human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells[J]. Cytotherapy, 11, 177 – 188.

[15] Wang S, Lu B, Tian C, Girman S, et al. Syngeneic mesenchymal stem cells rescue vision and vascular pathology in a rodent model of retinal degeneration[J]. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2009. 50.

1.福建省重點(diǎn)科研課題(基金編號(hào)：2008Y0040)；2.國(guó)家衛(wèi)生部科研基金課題(基金編號(hào):WKJ2008-2-617)。

徐國(guó)興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。