白 月 徐國(guó)興 莊 華 謝茂松 郭 健 王婷婷

誘導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞的應(yīng)用

白 月 徐國(guó)興 莊 華 謝茂松 郭 健 王婷婷

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

近年來，人們研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在體外可經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，抗氧化劑誘導(dǎo)，中藥誘導(dǎo)，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP等不同途徑的誘導(dǎo)方法，分化為神經(jīng)外胚層來源的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，因此一些研究者嘗試以上誘導(dǎo)途徑使MSCs分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞，用于體內(nèi)相關(guān)疾病的細(xì)胞替代治療，為多種疾病帶來了新的治療思路。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 體外誘導(dǎo) 視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育全能性，理論上可誘導(dǎo)分化為機(jī)體所需的任何組織或器官，但涉及倫理學(xué)問題，以往受到很大限制，發(fā)展緩慢。應(yīng)用眼色素上皮緣的視網(wǎng)膜干細(xì)胞[1]及鼠腦神經(jīng)先祖細(xì)胞移植[2]也由于供體組織有限性及安全性問題，不利于治療視網(wǎng)膜疾病的開展。于是有人把目光投向成體干細(xì)胞中的MSCs，成年動(dòng)物骨髓有2類干細(xì)胞群：造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。最初因其容易貼壁呈成纖維細(xì)胞樣克隆生長(zhǎng)，被稱為成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F）[3],后來研究發(fā)現(xiàn)它是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在體內(nèi)外均具支持和調(diào)控造血的作用，且具有多向分化潛能，故又稱其為間充質(zhì)干細(xì)胞[4]。也稱為骨髓基質(zhì)細(xì)胞[5]。

MSCs的特點(diǎn)為:①來源于中胚層，可以跨系統(tǒng)甚至跨胚層分化為3個(gè)胚層來源的細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織的細(xì)胞（視網(wǎng)膜來源于胚胎期神經(jīng)外胚層），并且經(jīng)過20~30次細(xì)胞分裂后，這種分化特性也不會(huì)消失[6]。②分離培養(yǎng)方便。③由于不表達(dá)T細(xì)胞識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)志，植入后不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。④易于轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因優(yōu)點(diǎn)[7],因此可把利于定向分化的生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)入MSCs，促使其定向分化。

MSC的純化方法有貼壁篩選法，流式細(xì)胞儀分選法，密度梯度離心法，免疫磁珠法。如果能找到更特異性標(biāo)記物，就可以獲得更純的MSCs，這對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有重要影響。

MSC為中胚層來源的干細(xì)胞，難于使其直接定向分化為外胚層來源的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[8]，而且MSC直接移植后只有少量細(xì)胞能分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，因此要通過MSC獲得神經(jīng)干細(xì)胞，再分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，進(jìn)一步分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。Nestin抗體（巢蛋白）為神經(jīng)干細(xì)胞的特異性抗體，而MAP-2抗體為成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)志。

MSC表達(dá)許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體以及細(xì)胞與細(xì)胞黏附作用的受體，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循環(huán)的調(diào)控。這成為不同方法誘導(dǎo)MSCs定向分化的理論基礎(chǔ)。目前，體外誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化有4種方法：生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，抗氧化劑誘導(dǎo)，中藥誘導(dǎo)，增加MSCs內(nèi)cAMP誘導(dǎo)。

1 生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)方法

Sanchez-Ramos等[9]將BMSC（Bone marrow stromal cells）用10ng/mLEGF預(yù)誘導(dǎo)，再用腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）誘導(dǎo)，見其表達(dá)巢蛋白（nestin）。同時(shí)也表達(dá)GFAP和 NeuN.當(dāng)將人或鼠的BMSCs與小鼠的中腦細(xì)胞或紋狀體細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果有很小比例（0.2%~5%）MSCs表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物-神經(jīng)膠質(zhì)元纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經(jīng)元標(biāo)記物-神經(jīng)元特異核蛋白(Neuron-specific nuclear protein,NeuN)。這種方法常用于誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞的研究。

張卉以含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）或表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)加bFGF，或bFGF、EGF加全反式維甲酸(ATRA)的培養(yǎng)液培養(yǎng)BMSCs, 經(jīng)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)72 h后 , 纖維連接蛋白（fibronectin）和 I型膠原（collagen I）免疫陽性細(xì)胞減少。轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）的nestin免疫陽性細(xì)胞增多。7d后其又減少。細(xì)胞分化后, 分化為神經(jīng)元（神經(jīng)元特異烯醇化酶-NSE）的陽性細(xì)胞最多占細(xì)胞總數(shù)的24.76%±2.72% ,同時(shí)分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的36.58%±3.26%[10]。bFGF參與骨髓MSC向神經(jīng)分化的啟動(dòng)[11]，同時(shí)bFGF又可促使神經(jīng)前體細(xì)胞對(duì)EGF產(chǎn)生反應(yīng)，兩者聯(lián)用有明顯的協(xié)同作用，發(fā)揮增殖效應(yīng)[12]。從胚胎發(fā)育的過程來看，EGF及其受體出現(xiàn)要比bFGF晚，研究表明EGF多促進(jìn)MSCs向膠質(zhì)前體細(xì)胞分化，而bFGF主要對(duì)神經(jīng)元前體細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用[13，14]。

有人在MSC培養(yǎng)基中加入神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子（glial growth factor,GGF）,觀察其可以向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，并表達(dá)GFAP。

Anthony等應(yīng)用activinA（活化蛋白A），牛磺酸和EGF對(duì)成人CD90+MSCs體外誘導(dǎo)分化后，20%~32%的細(xì)胞表達(dá)感光細(xì)胞特異標(biāo)志——視紫紅質(zhì)，視蛋白，recoverin(恢復(fù)蛋白)[8]。受此實(shí)驗(yàn)啟發(fā)，可知在不同的化學(xué)誘導(dǎo)條件下，MSCs可能分化為不同類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞。

孫旭芳等[15]用DMEM/F12(含10%FCS胎牛血清和100u/mL P/S) 1:1添加0.6%葡萄糖，1×ITS（胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒化物，insulin transferring selenium）,2mM谷酰胺，3mM碳酸氫鈉，20ng/mLEGF,20ng/mLbFGF,5mMHepes制成分化液Ⅰ誘導(dǎo)6~10代rMSC14天后，檢測(cè)其高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin。培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞, 收集視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入10%的FCS,與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液按照1:1混合，制成分化液Ⅱ，使形成的神經(jīng)球形體在模擬眼內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)下分化出視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞，48h用免疫熒光檢測(cè)，部分細(xì)胞NeuN,Thy1.1染色陽性（Thy-1位于哺乳動(dòng)物RGCs.Thy-1.1抗原僅表達(dá)在大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上，用于鑒定大鼠RGCs），少數(shù)細(xì)胞表達(dá)GFAP。

牟大鵬等[16]先把分離到的視網(wǎng)膜組織加入DMEM培養(yǎng)液并用阿糖胞苷（Ara-C以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖后）處理后，將視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，真空抽濾后按2:3比例與DMEM培養(yǎng)液混合后誘導(dǎo)分化2~4代的rMSCs,2d后即可見神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)，7d神經(jīng)元樣細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的26~27%，免疫熒光檢測(cè)β–tubulinⅢ（又稱微管蛋白是RGCs早期和成熟期的標(biāo)志物）陽性為18%±3%，Neurofilament protein(NF，神經(jīng)絲蛋白，是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物)陽性率為23%±4%，3天后免疫組化Nestin陽性數(shù)為30.9%±7.7%，MAP-2染色陽性。

在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞上清液制成的微環(huán)境中，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)如各種糖蛋白，粘蛋白，各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，各種細(xì)胞因子等可以維持骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞生存，并向特定的視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的良好環(huán)境。

bFGF誘導(dǎo)方法是誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元方向分化的經(jīng)典方法[17]，其優(yōu)點(diǎn)在于可以獲得較多的神經(jīng)元樣細(xì)胞。劉東寧等[18]先用含10ng/mL bFGF的DMEM/F12(10%FBS)預(yù)誘導(dǎo)24h,再加入DMEM/F12,10ng/mL bFGF,2%二甲基亞砜，200umol/L丁羥茴醚，10umol/L福斯高林，5mmol/L KCl,2mmol/L丙戊酸，5ug/mL胰島素的神經(jīng)誘導(dǎo)基誘導(dǎo)第3代BMSCs7天。免疫化學(xué)鑒定1~7d可見神經(jīng)元樣細(xì)胞MAP-2(抗微絲微管相關(guān)蛋白-2)74.2%，Thy1.1陽性，GFAP陰性。也說明bFGF誘導(dǎo)后細(xì)胞主要向成熟神經(jīng)元方向分化，而不是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。bFGF誘導(dǎo)雖然可以獲得較多的成熟神經(jīng)元，但難以長(zhǎng)期存活，聯(lián)合其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子進(jìn)行維持培養(yǎng)，有利于誘導(dǎo)后神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活。

BMSCs與新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)后可分化為RGCs(retinal ganglion cells,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)特異性抗體Thy1.1表達(dá)陽性的細(xì)胞[19]。利用出生1~3d的乳鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞作為誘導(dǎo)劑置于Transwell雙層培養(yǎng)板的上層使未成熟的視網(wǎng)膜組織內(nèi)促進(jìn)原始視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化和發(fā)育的細(xì)胞因子，受體(BDNF,NGF,TrkB受體等)及細(xì)胞外基質(zhì)成分，通過上層濾膜孔擴(kuò)散至下層BMCs周圍，模擬了原始視網(wǎng)膜發(fā)育的微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)說明BMSCs經(jīng)化學(xué)性誘導(dǎo)和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)均可特異性分化為具有RGCs表型的細(xì)胞。

一些體外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，還有許多因子調(diào)節(jié)MSC的分化方向，如胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulinlike growth factorⅠ,IGFⅠ)和腦源性生長(zhǎng)因子(brain-derived growth factor,BDGF)被證實(shí)支持神經(jīng)元方向分化。而睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophlic factor,CNF）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）作用于多潛能MSC,誘導(dǎo)它們分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞.

2 抗氧化劑誘導(dǎo)

活性氧(ROS)是氧分子還原成水時(shí)產(chǎn)生的許多活性中間體的統(tǒng)稱,包括過氧化氫(H2O2/超氧陰離子(O2ˉ)/羥自由基(·OH)等。有學(xué)者證實(shí)[20]抗氧化劑可上調(diào)細(xì)胞P53基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的同時(shí)可下調(diào)c-myc基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞周期誘導(dǎo)干細(xì)胞分化。

Woodbury 等[21]報(bào)道,將鼠和成年人的MSCs先用2-巰基乙醇（ME-2）的DMEM/FBS誘導(dǎo)，以啟動(dòng)MSCs的神經(jīng)細(xì)胞分化，接近80%出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的表型和表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）,NF-M（神經(jīng)絲蛋白）,NeuN（神經(jīng)元特異性核內(nèi)抗原）。進(jìn)一步用二甲亞砜，丁羥基苯甲醚，叔丁基對(duì)甲氧酚的DMEM中誘導(dǎo)，一周內(nèi)超過50%的MSCs出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，且以神經(jīng)元標(biāo)記物NSE，M-神經(jīng)絲或Tau增高為主。

項(xiàng)鵬等[22]分別采用含巰基乙醇和硫代甘油等試劑的無血清DMEM誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元，結(jié)果示誘導(dǎo)24小時(shí),MSCs中約75.5%的NSE 陽性而GFAP陰性。賈延劼等[23]在β-巰基乙醇預(yù)誘導(dǎo)MSCs 24h ,再誘導(dǎo)5h, NSE表達(dá)率為 (63.7±4.5 ) %。

3 中藥誘導(dǎo)

肖慶忠等[24]采用含100 ~ 150mg/L麝香多肽的無血清L -DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)成年大鼠和人BMMSCs分化為神經(jīng)元，免疫組化顯示神經(jīng)元樣細(xì)胞NSE（93.5%）,NF（88.2%）,nestin表達(dá)陽性，GFAP陰性。

項(xiàng)鵬等[25]分別采用含丹參注射液或硫代甘油等試劑的無血清達(dá)樂伯克改良必需基本培養(yǎng)基 (DMEM)誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元。與傳統(tǒng)的誘導(dǎo)分化劑硫代甘油相似，但細(xì)胞存活時(shí)間較久。

撒亞蓮[26]用三七總皂甙和賈延劼等用黃荃甙誘導(dǎo)MSCs,均得到同樣的結(jié)果。此外,黃芪、天麻、人參、當(dāng)歸、腦新舒、人參蜂王漿多種傳統(tǒng)中藥成分及中藥制劑體外均能誘導(dǎo)大鼠分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[27]。

4 增加MSCs內(nèi)cAMP誘導(dǎo)其分化

可從基因水平上，誘導(dǎo)MSCs沿著特定的路徑增殖發(fā)育成各種神經(jīng)細(xì)胞。

Deng weiwen等[28]發(fā)現(xiàn)未分化的hMSCs可表達(dá)一些神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物，如微管蛋白(TuJ-1，neuron-specific tubulin), 神經(jīng)元特異性烯醇酶（NSE），微管相關(guān)蛋白(MAP1B，microtubule-associated protein 1B)及波形蛋白(vimentin)。在培養(yǎng)基內(nèi)加入誘導(dǎo)劑0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IMBX，isobutylmethylxanthine)和1mM cAMP類似物雙丁酰環(huán)磷腺苷(dbcAMP，dibutyryl cyclic AMP)，誘導(dǎo)6天,約有25%的MSCs 分化為典型的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài), NSE 和 vimentin表達(dá)增高,且這種分化是不可逆的。提示：在體外，通過增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，可使MSCs分化為早期的神經(jīng)前體細(xì)胞。

項(xiàng)鵬、夏文杰等[29]采用含腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑Forskolin及磷脂酶抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的無血清DMEM誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元。

5 幾種誘導(dǎo)因素的比較

對(duì)以上幾種誘導(dǎo)因素綜合比較可用增加胞內(nèi)cAMP使MSCs分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，用抗氧化劑誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)途徑分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞。此外應(yīng)用中藥誘導(dǎo)也不失為一種可行方法。雖然后三種方法還未應(yīng)用于誘導(dǎo)MSCs分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞，但卻展示了其良好的發(fā)展前景。

6 問題與展望

不僅是不同誘導(dǎo)途徑的差別，在MSCs培養(yǎng)，MSCs表面標(biāo)志的檢測(cè)，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)，MSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞的分化，每一個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響免疫組化和RT-PCR監(jiān)測(cè)到的陽性率。影響MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的因素比較復(fù)雜：有內(nèi)源性因素，如細(xì)胞質(zhì)對(duì)核的影響；外源性因素，如相鄰細(xì)胞的相互作用；細(xì)胞外環(huán)境因素：如細(xì)胞因子，激素等。而且這些因素如何起作用的機(jī)制不清，還需從形態(tài)特征，超微結(jié)構(gòu)，分子生物學(xué)，生理學(xué)等角度進(jìn)一步研究。不能急功近利的在短期內(nèi)制備出完美的微環(huán)境，只能以體外一次次分析每個(gè)誘導(dǎo)因素的作用，逐漸完善模擬的微環(huán)境。誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具有視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的一系列功能還不是完全清楚。并且對(duì)這些因子的研究大多是在體外排除其他因素影響的情況下進(jìn)行研究的，而在體內(nèi)則是通過相互作用起效應(yīng)的，如何發(fā)揮多種因子協(xié)同作用，仍待解決。

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福建省重點(diǎn)科研課題（基金編號(hào)：2008Y0040）。

徐國(guó)興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。