張先成，趙曉宇，孟利強(qiáng)

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江，哈爾濱，150010）

纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富、生成量最高的有機(jī)化合物［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的纖維素最高達(dá)17000億t［2］。其中大部分尚未被利用或未被合理利用(如直接焚燒)，目前全世界被開發(fā)利用的農(nóng)林纖維副產(chǎn)物不足2%,我國約有50%以上的農(nóng)林廢棄物在田間地頭被白白燒掉［3］。這不僅浪費(fèi)了寶貴的自然資源，而且污染了環(huán)境，對氣候、生態(tài)等也造成了嚴(yán)重的影響［3］。若能將這些廢棄物通過生物轉(zhuǎn)化成燃料或蛋白質(zhì)，非但不會減少糧食生產(chǎn)，還能協(xié)助解決現(xiàn)代廢物處置問題，從而減少環(huán)境污染，既能以乙醉的形式提供使用方便、可再生的能源來減少對礦物燃料的依賴，又能緩解糧食和動物飼料短缺。比如說，我國每年僅剩余的秸稈有1億t，如果其中一半加以利用，可產(chǎn)酒精1000萬t。由此可見，植物纖維素這種可再生資源的潛在價值是不可估量的，纖維素資源的綜合利用具有廣闊的開發(fā)前景［4］。

在纖維素資源的綜合利用上篩選到高效纖維素分解菌，是利用纖維素的關(guān)鍵，但由于我國北方冬季時間長、氣溫低，纖維素降解慢，多而且為期綜合利用數(shù)纖維素降解菌的生長溫度都比較高、降解能力低，不適宜在年平均氣溫較低的北方應(yīng)用。

本項(xiàng)研究立足于黑龍江省的實(shí)際情況，從牛糞中分離篩選出高效纖維素分解性細(xì)菌，為我省豐富的纖維素資源的充分利用提供寶貴的菌株資源，而且為其綜合利用提供了一條嶄新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

黑龍江省哈爾濱市道里區(qū)太平鎮(zhèn)奶牛牛糞

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 肉汁胨培養(yǎng)基

牛肉膏：3g，蒸餾水：1000ml，蛋白胨：10g，NaCl：5g，pH：7.2～7.4

1.2.2 初篩培養(yǎng)基（依姆歇涅茨基纖維素分解菌培養(yǎng)基）［5］

K2HPO4：1g，F(xiàn)eC13·5H2O：0.1g，MgSO4· 7H2O：0.3g，CaCl2：0.1g，NaCl：0.1g，NaNO3：2.5g， 蒸 餾 水 ：l000ml，pH：7.2～7.4

將培養(yǎng)基分裝試管內(nèi)，然后加入濾紙條一張(普通濾紙剪成5×0.7cm或7×1cm紙條)，紙條貼于試管內(nèi)壁，一半浸入培養(yǎng)液中，一半暴露于空氣中，121℃，滅菌20-30min［6］。

1.2.3 分離培養(yǎng)基［7］

CMC-Na：0.5%，營養(yǎng)鹽：100ml，瓊脂 2% ，pH：7.2營養(yǎng)鹽:

(NH4)H2PO4：0.5g，MnSO4·H2O：2.5g，K2HPO4：2g，F(xiàn)eSO4·7H2O：7.5mg，MgSO4：2g，NaCl：0.3g，自來水 ：1000ml

1.2.4 纖維素分解菌鑒別培養(yǎng)基（剛果紅纖維素培養(yǎng)基）

K2HPO4：0.59，MgSO4：0.25g，剛果紅：0.24g，瓊脂14.00g，纖維素粉 l.88g，明膠 2.00g，土壤浸汁：100ml，蒸餾水：900 ml，pH：7.0

配制前應(yīng)對纖維素粉和瓊脂進(jìn)行預(yù)處理，纖維素應(yīng)加lmol/L的HCL溶液浸泡12h，然后蒸餾水洗多次至pH值中性，烘干。

1.2.5 細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基

蛋白胨：0.3%，MgSO4·7H2O：0.03%，酵母膏：0.05% ，CaC12·2H2O：0.03%

KH2PO4：0.4%，CMC-Na：0.5% ，pH：7.2～7.3

1.3 試劑及緩沖液

1.3.1 3，5一二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)

甲液：溶解6.99結(jié)晶酚于15.2ml、10%氫氧化納溶液中，并用水稀釋至69ml，在此溶液中加6.9gNaHSO3。

乙液:稱取255g酒石酸鉀鈉加到300ml、10%氫氧化鈉溶液中，再加入880ml、1%3，5-二硝基水楊酸溶液。

將甲、乙二液相混合即得黃色試劑，貯存于棕色瓶中室溫放置7～10d后使用。

1.3.2 pH4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液

吸取20ml0.2mol/L的醋酸和30ml0.2mol/L的醋酸鈉混勻。

1.3.3 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)緩沖液

用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)以pH4.4的醋酸緩沖液配成0.5%的溶液。

1.3.4 0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

分析純葡萄糖105℃干燥到恒重后，準(zhǔn)確稱取100mg，用少量蒸餾水溶解并定容至100ml，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 1.0mol/LHCl溶液、1.0mol/LNaOH 溶液

1.4 方法

1.4.1 低溫微生物的生長情況觀察

用液體肉汁胨培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，在5℃的低溫條件下培養(yǎng)7d觀察。目測樣品中菌株在低溫條件下的生長情況。

1.4.2 菌種的分離與初篩［8］

將樣品稀釋成10－1～10－9的各級濃度的稀釋液，將裝有“初篩培養(yǎng)基”的試管編號，用無菌移液管吸取lml稀釋液對號接種在有“初篩培養(yǎng)基”的試管中，培養(yǎng)至濾紙條上出現(xiàn)潰爛斑，選擇濾紙潰爛程度高的試管，從潰爛處挑取菌落于“分離培養(yǎng)基平板”，多次劃線分離，分離至得到純化的單菌落，將得到的單菌落點(diǎn)種于剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，測量分解纖維素的透明圈直徑大小，進(jìn)行初篩。

1.4.3 菌種的復(fù)篩（測定發(fā)酵液的酶活性）

1.4.3.1 粗酶液的制備

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在150r/min搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，將發(fā)酵液直接于3000r/min，4℃離心15min，取上清液。

1.4.3.2 纖維素酶活性(CMCase)的測定［9］

酶活測定：移取含有0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的醋酸緩沖液（0.05mol/L，pH4.4）1.5ml于試管中，加入酶液0.5ml，50℃，反應(yīng)30min，加入DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到25ml,在520nm處測還原糖。從還原糖的數(shù)量來求得酶活力的大小。

酶活性單位定義：pH4.4、50℃條件下每毫升纖維素粗酶液能水解羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，產(chǎn)生1ug的葡萄糖，稱為一個纖維素酶活單位，單位：U/ml。

1.4.3.3 還原糖的測定(比色法定糖)方法［10］

本研究中采用3，5-二硝基水楊酸比色法，又稱DNS法。

原理:3，5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原糖的醛基還原成棕色的氨基化合物，即3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成比例關(guān)系，利用該方法可測定還原糖濃度。該方法操作簡單、快速，較少受其它雜質(zhì)干擾而重現(xiàn)性好，所以被用來測定纖維素酶水解產(chǎn)生的還原糖的濃度。

1.4.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取9支比色管，在其中加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液等試劑，將各管溶液混勻后，在721分光光度計(jì)上(52Onm)進(jìn)行比色測定，用空白管溶液調(diào)零后，測定各管光密度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。(見圖1)

根據(jù)菌株的生物量和產(chǎn)酶活性對菌株進(jìn)行篩選，從而篩選出高效的纖維素分解菌株。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.4.4 高效纖維素降解菌產(chǎn)酶特性研究［11］

1.4.4.1 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響

將菌種接種于種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng) (溫度5℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min)，每隔24h取樣測生物量以及測酶活，通過酶活隨接種量的變化繪制產(chǎn)酶曲線。取產(chǎn)酶最高的培養(yǎng)時間作為最適培養(yǎng)時間。

1.4.4.2 培養(yǎng)基起始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

用1mol/L的HCl或lmol/LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值，使 pH 值分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，將菌種接種于不同pH值的種子培養(yǎng)基中，三角瓶搖床培養(yǎng)(溫度5℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min)，48h后取樣測生物量以及測酶活，通過酶活隨接種量的變化繪制產(chǎn)酶曲線。取產(chǎn)酶最高的起始pH值作為最適起始pH值。

1.4.4.3 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

將菌種接種于改變了氮源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別以1.5g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏；0.5g/L的硫酸銨、氯化銨、硝酸銨為不同氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，三角瓶搖床培養(yǎng)(溫度5℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min)，48h后取樣測生物量以及測酶活，通過酶活隨pH值的變化繪制產(chǎn)酶曲線。取產(chǎn)酶最高的氮源作為培養(yǎng)基最適氮源。

1.4.4.4 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別加入2%、3%、4%、5%、6%、7%的種子培養(yǎng)液，三角瓶搖床培養(yǎng)(溫度5℃，搖床轉(zhuǎn)速n=150r/min)，48小時后取樣測生物量以及測酶活，通過酶活隨接種量的變化繪制產(chǎn)酶曲線。取產(chǎn)酶最的接種量作為最適接種量。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 菌株的分離與初篩

采集的樣品經(jīng)分離純化共得到50株細(xì)菌菌株。在初篩平板上培養(yǎng)48h后，經(jīng)含有剛果紅的纖維素鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中有4株菌株的透明圈比較明顯，它們在剛果紅鑒別平板上的透明圈直徑（見表1）。纖維素分解細(xì)菌分泌纖維素酶而將平板培養(yǎng)基中的纖維素降解成小分子的低聚糖及纖維二糖、葡萄糖等，水解后的糖列同剛果紅染?？梢孕纬杉t色沉淀。因此在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，纖維素分解菌周圍均能形成紅色的水解圈，且水解圈的大小同酶活的高低有一定的數(shù)量關(guān)系。因此，剛果紅纖維素平板透明圈篩選法可用于識別產(chǎn)纖維素酶的菌株，可用于初步判定酶活性高低。產(chǎn)酶越多，透明圈越大，產(chǎn)酶越快，透明圈出現(xiàn)越早。然而，雖然透明圈大小直接反映了酶濃度高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，因?yàn)槊敢簶悠返拿笣舛扰c透明圈的直徑呈線性關(guān)系，可以對酶活進(jìn)行初步定量。但是僅以水解圈大小作為菌株產(chǎn)纖維素酶活力大小的唯一定量指標(biāo)是不太可靠的，其原因是對方面的，如固體和液體培養(yǎng)基條件不同；不同菌株具有不同的生長和產(chǎn)酶速度以及不同的纖維素酶系；菌苔大小及在平板上堆積情況的差異等都會造成透明圈大小與液體發(fā)酵酶活的不完全一致，所以液體發(fā)酵復(fù)篩必不可少。

表1 初篩出的4株纖維素分解型細(xì)菌的菌落直徑和透明圈直徑Table 1 Colonydiameter and clear zone diameter of4 strains of cellulose-decomposingbacteria

2.1.2 菌株的復(fù)篩

將初篩得到的4株細(xì)菌菌株接入復(fù)篩細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖甁培養(yǎng)，采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）分別測定J-019、J-039、J-048和J-050菌株產(chǎn)纖維素酶的酶活，酶活分別為523U、422U、466U和407U。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選出1株活力最高的菌株J-019，并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究。

2.1.3 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響

按1.2.4.1方法，獲得J-019隨培養(yǎng)時間變化的產(chǎn)酶曲線圖(如圖2)。

圖2 培養(yǎng)時間對J-019產(chǎn)酶的影響Fig.2 The effect of culture time on enzyme production of J-019

由圖2可以看出，在24h的時候，酶活已經(jīng)較高，到48h的時候酶活最大，達(dá)到551U，之后酶活下降很快，72h后，到酶活基本穩(wěn)定，可以看出當(dāng)培養(yǎng)48h時菌株正值產(chǎn)酶高峰，并不是隨培養(yǎng)時間的增加產(chǎn)酶也隨之增加，原因是菌體快速繁殖，到達(dá)對數(shù)生長后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡及溶解氧濃度低下，細(xì)菌活力降低，從而使產(chǎn)酶量降低，所以培養(yǎng)48h為菌株J-019菌株的最適產(chǎn)酶溫度。

2.1.4 培養(yǎng)基起始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

按1.2.4.2方法，獲得J-019隨培養(yǎng)基起始pH值變化的產(chǎn)酶曲線圖(如圖3)。

圖3 培養(yǎng)基起始pH值對J-019產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of initial pH value of medium on enzyme production of J-019

由圖3可以看出，培養(yǎng)基起始pH值對菌株產(chǎn)酶有很大影響，當(dāng)起始pH值在4～7之間時，隨pH值升高，菌株酶活出現(xiàn)上升高趨勢，在pH值為7時，菌株酶活最高，酶活為557U，菌株酶活僅次于pH值為7時的酶活，當(dāng)起始pH值大于7時菌株酶活下降，起始pH值為大于8以后菌株酶活下降比較明顯，起始pH值在6～8之間時菌株酶活比較穩(wěn)定，且pH值等于7為菌株J-019菌株產(chǎn)酶的最適起始pH值。

2.1.5 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

按1.2.4.3方法，獲得J-019隨培養(yǎng)基不同氮源變化的產(chǎn)酶曲線圖(如圖4)。

圖4 不同氮源對J-019產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effect of different nitrogen sources on enzyme production of J-019

由圖4可以看出，培養(yǎng)基氮源對菌株產(chǎn)酶有很大影響，分別以蛋白胨、牛肉膏和酵母膏為氮源時，菌株酶活比較高，可以看出有機(jī)氮源促進(jìn)產(chǎn)酶的效果明顯好于無機(jī)氮源，因?yàn)橛袡C(jī)氮源相比于硫酸銨等無機(jī)氮源更容易被J-019菌株所利用來促進(jìn)其產(chǎn)酶。其中以蛋白胨為氮源時，菌株酶活最高，酶活為547U，所以蛋白胨為J-019菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基氮源。

2.1.6 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

按1.2.4.4方法，獲得J-019隨接種量變化的產(chǎn)酶曲線圖(如圖 5)。

圖5 接種量對J-019產(chǎn)酶的影響Fig.5 The effect of inoculation amount on enzyme production of J-019

由圖5可以看出，接種量對菌株產(chǎn)酶有很大影響，接種量從2%～4%時，酶活急劇增加，在接種量為4%時酶活達(dá)到最大值，酶活為539U，接種量在4%以后酶活有所下降，接種量在5%～7%之間，酶活基本穩(wěn)定，這說明接種量為4%時有利于菌株產(chǎn)酶，而過高或過低的接種量效果都不好，原因是接種量過低，菌體繁殖慢，產(chǎn)酶量低，接種量過高，由于菌體的快速繁殖，會導(dǎo)致營養(yǎng)物的競爭及溶解氧濃度低下，細(xì)菌活力降低，從而使產(chǎn)酶量降低，所以4%的接種量時為J-019菌株產(chǎn)酶的最適接種量。

2.2 討論

能夠降解纖維素的微生物有很多，如：真菌、細(xì)菌和放線菌都參與纖維素的分解過程。但由于細(xì)菌繁殖速度快，發(fā)酵周期短，有利于工業(yè)生產(chǎn)。在制漿、造紙和洗滌工業(yè)等污染行業(yè)的廢水治理上有著潛在的應(yīng)用前景，近年來關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的研究日益引起人們的重視，尤其我省的纖維素資源豐富，纖維素資源的綜合利用前景廣闊，但現(xiàn)有的纖維素分解性細(xì)菌的生長及產(chǎn)酶溫度一般都比較高，并不適合在年平均氣溫較低的我省應(yīng)用。本研究結(jié)合我省的實(shí)際情況，在低溫條件下從牛糞中分離能降解纖維素的細(xì)菌菌株，通過初篩、復(fù)篩最終篩選出1株酶活比較高的菌株J-019，并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，找出了菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基起始pH值、培養(yǎng)基氮源和接種量，分別為：最適培養(yǎng)時間為48h,最適培養(yǎng)基起始pH值為pH=7,最適培養(yǎng)基氮源為蛋白胨，最適接種量為4%。該菌株比較適合我省年平均氣溫較低的實(shí)際情況，并且具有較高的纖維素酶活性，具有比較好的應(yīng)用前景，在今后的研究中將進(jìn)一步對該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行摸索，并可以通過誘導(dǎo)等方法進(jìn)一步提高酶活力。

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